| 摘要 | 第3-4页 |
| ABSTRACT | 第4-5页 |
| 图表清单 | 第13-14页 |
| 缩略词表 | 第14-15页 |
| 第一章 干扰素的研究概况 | 第15-28页 |
| 1 干扰素的分类及特征 | 第16-18页 |
| 2 干扰素的分子结构及特点 | 第18-19页 |
| 3 干扰素的产生与作用特性 | 第19-23页 |
| 3.1 干扰素受体 | 第20页 |
| 3.2 干扰素的信号转导与基因调控 | 第20-22页 |
| 3.3 干扰素诱生剂 | 第22-23页 |
| 4 干扰素的生物学功能 | 第23-28页 |
| 4.1 抗病毒活性 | 第23-25页 |
| 4.2 抗肿瘤活性 | 第25页 |
| 4.3 抗寄生虫活性 | 第25-26页 |
| 4.4 免疫调节活性 | 第26-27页 |
| 4.5 免疫佐剂活性 | 第27-28页 |
| 第二章 禽类干扰素的研究进展 | 第28-31页 |
| 第三章 研究的目的和意义 | 第31-32页 |
| 第四章 扬州鹅IFN-α基因的克隆与生物信息学分析 | 第32-52页 |
| 1 材料 | 第32-35页 |
| 1.1 实验动物 | 第32页 |
| 1.2 表达载体与菌株 | 第32页 |
| 1.3 仪器设备 | 第32-33页 |
| 1.4 主要试剂及其配制 | 第33-35页 |
| 1.4.1 培养基 | 第33-34页 |
| 1.4.2 总RNA的提取与细胞培养所需试剂 | 第34页 |
| 1.4.3 粗提质粒试剂 | 第34-35页 |
| 1.4.4 核酸电泳试剂 | 第35页 |
| 1.4.5 感受态细胞制备试剂 | 第35页 |
| 2 方法 | 第35-42页 |
| 2.1 扬州鹅IFN-α基因的RT-PCR扩增 | 第35-39页 |
| 2.1.1 引物设计与合成 | 第35-36页 |
| 2.1.2 提取扬州鹅外周血总RNA | 第36-37页 |
| 2.1.2.1 提取经刀豆素(ConA)诱导培养的鹅外周血淋巴细胞的总RNA | 第36-37页 |
| 2.1.2.2 提取未经诱导培养的鹅外周血淋巴细胞的总RNA | 第37页 |
| 2.1.2.3 提取鹅外周血淋巴细胞中总RNA | 第37页 |
| 2.1.2.4 提取鹅外周全血中的总RNA | 第37页 |
| 2.1.3 RT-PCR扩增扬州鹅IFN-α全长基因 | 第37-38页 |
| 2.1.3.1 GoIFN-α基因的反转录(RT) | 第37-38页 |
| 2.1.3.2 GoIFN-α全长基因的PCR扩增 | 第38页 |
| 2.1.4 扩增产物的纯化 | 第38-39页 |
| 2.2 扬州鹅IFN-α基因的T-载体克隆与鉴定 | 第39-42页 |
| 2.2.1 IFN-α基因与pGEM-T easy的连接 | 第39页 |
| 2.2.2 感受态细胞的制备及连接产物的转化 | 第39-40页 |
| 2.2.2.1 DH5a感受态细饱的制备 | 第39-40页 |
| 2.2.2.2 连接产物转化感受态细胞 | 第40页 |
| 2.2.3 转化菌落的筛选与鉴定 | 第40-42页 |
| 2.2.3.1 阳性重组质粒的筛选 | 第40-41页 |
| 2.2.3.2 重组质粒pGEM-T-GoIFN-α的鉴定 | 第41-42页 |
| 3 结果 | 第42-50页 |
| 3.1 扬州鹅IFN-α全基因的扩增 | 第42-43页 |
| 3.2 克隆质粒pGEM-T-GoIFN-α的鉴定 | 第43-45页 |
| 3.3 扬州鹅IFN-α基因的生物信息学分析 | 第45-50页 |
| 3.3.1 扬州鹅IFN-α核苷酸序列测序结果 | 第45-46页 |
| 3.3.2 扬州鹅IFN-α氨基酸序列测序结果 | 第46页 |
| 3.3.3 扬州鹅IFN-α同源性分析 | 第46-49页 |
| 3.3.4 扬州鹅IFN-α进化树分析 | 第49-50页 |
| 4 讨论 | 第50-52页 |
| 4.1 RNA提取方法的分析 | 第50页 |
| 4.2 扬州鹅IFN-α同源性等生物信息学分析 | 第50-52页 |
| 第五章 扬州鹅IFN-α基因的原核表达与高免血清的制备 | 第52-77页 |
| 1 材料 | 第52-55页 |
| 1.1 实验动物 | 第52页 |
| 1.2 表达载体与菌株 | 第52-53页 |
| 1.3 仪器设备 | 第53页 |
| 1.4 主要试剂及其配制 | 第53-55页 |
| 1.4.1 培养基 | 第54页 |
| 1.4.2 粗提质粒试剂 | 第54页 |
| 1.4.3 核酸电泳试剂 | 第54页 |
| 1.4.4 感受态细胞制备试剂 | 第54页 |
| 1.4.5 原核表达所需试剂 | 第54页 |
| 1.4.6 蛋白质电泳和Western Blotting所需试剂 | 第54-55页 |
| 1.4.7 ELISA试剂 | 第55页 |
| 2 方法 | 第55-66页 |
| 2.1 扬州鹅IFN-α成熟肽基因的RT-PCR | 第55-56页 |
| 2.1.1 引物设计与合成 | 第55-56页 |
| 2.1.2 RT-PCR扩增扬州鹅IFN-α成熟肽基因 | 第56页 |
| 2.1.2. 1 GoIFN-α基因的反转录(RT) | 第56页 |
| 2.1.2.2 GoIFN-α成熟肽基因的PCR扩增 | 第56页 |
| 2.1.3 扩增产物的纯化 | 第56页 |
| 2.2 载体pET32a(+)质粒提取、酶切与回收纯化 | 第56-57页 |
| 2.3 扬州鹅IFN-α成熟肽基因的原核表达载体的构建 | 第57-59页 |
| 2.3.1 目的片段与pET32a(+)载体的连接 | 第57-58页 |
| 2.3.2 感受态细胞的制备与连接产物的转化 | 第58页 |
| 2.3.3 重组质粒的筛选与鉴定 | 第58-59页 |
| 2.3.3.1 阳性重组质粒的筛选 | 第58页 |
| 2.3.3.2 重组质粒pET32a-mGoIFN-α的鉴定 | 第58-59页 |
| 2.4 重组蛋白的诱导表达 | 第59-64页 |
| 2.4.1 重组质粒pET32a-mGoIFN-α转化表达菌 | 第59页 |
| 2.4.2 工程菌的诱导表达 | 第59-60页 |
| 2.4.3 SDS-PAGE电泳 | 第60-61页 |
| 2.4.4 表达条件的优化 | 第61-62页 |
| 2.4.4.1 诱导时间的摸索 | 第61页 |
| 2.4.4.2 IPTG最佳浓度的摸索 | 第61-62页 |
| 2.4.5 可溶性重组蛋白的制备及鉴定 | 第62-63页 |
| 2.4.5.1 包涵体蛋白的纯化与溶解 | 第62页 |
| 2.4.5.2 重组蛋白的溶解、复性及鉴定 | 第62-63页 |
| 2.4.6 目的蛋白的Western Blotting鉴定 | 第63-64页 |
| 2.5 高免血清的制备 | 第64-66页 |
| 2.5.1 重组蛋白抗原的制备 | 第64页 |
| 2.5.2 免疫程序 | 第64页 |
| 2.5.3 ELISA法检测抗原免疫原性 | 第64-65页 |
| 2.5.4 Western Blotting法检测抗体特异性 | 第65-66页 |
| 3 结果 | 第66-75页 |
| 3.1 扬州鹅IFN-α成熟肽基因的扩增 | 第66-67页 |
| 3.2 克隆质粒pET32a-mGoIFN-α的鉴定 | 第67-68页 |
| 3.3 重组蛋白的表达鉴定及条件优化 | 第68-72页 |
| 3.3.1 重组蛋白pET32a-mGoIFN-α的表达 | 第68-70页 |
| 3.3.2 诱导时间的优化 | 第70-71页 |
| 3.3.3 IPTG最佳浓度的优化 | 第71-72页 |
| 3.4 扬州鹅IFN-α成熟蛋白的纯化 | 第72-73页 |
| 3.5 扬州鹅IFN-α成熟蛋白的Western Blotting鉴定 | 第73页 |
| 3.6 扬州鹅IFN-α成熟蛋白多克隆抗体效价检测 | 第73-74页 |
| 3.7 鼠抗血清的Western Blotting检测 | 第74-75页 |
| 4 讨论 | 第75-77页 |
| 4.1 载体与宿主菌的选择 | 第75页 |
| 4.2 表达蛋白的纯化 | 第75-76页 |
| 4.3 扬州鹅IFN-α的免疫原性 | 第76-77页 |
| 第六章 扬州鹅IFN-α基因的真核表达及抗病毒活性检测 | 第77-91页 |
| 1 材料 | 第77-80页 |
| 1.1 细胞与毒株 | 第77页 |
| 1.2 表达载体 | 第77-78页 |
| 1.3 仪器设备 | 第78页 |
| 1.4 主要试剂及其配制 | 第78-80页 |
| 1.4.1 培养基 | 第79页 |
| 1.4.2 粗提质粒试剂 | 第79页 |
| 1.4.3 核酸电泳试剂 | 第79页 |
| 1.4.4 感受态细胞制备试剂 | 第79页 |
| 1.4.5 细胞培养试剂 | 第79-80页 |
| 2 方法 | 第80-87页 |
| 2.1 扬州鹅IFN-α真核表达重组质粒的构建与鉴定 | 第80-82页 |
| 2.1.1 目的基因的制备 | 第80页 |
| 2.1.2 载体pcDNA3.1(-)的准备 | 第80-81页 |
| 2.1.3 目的片段与pcDNA3.1(-)载体的连接 | 第81页 |
| 2.1.4 感受态细胞的制备与连接产物的转化 | 第81页 |
| 2.1.5 重组质粒的筛选与鉴定 | 第81-82页 |
| 2.1.5.1 阳性重组质粒的筛选 | 第81-82页 |
| 2.1.5.2 重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α的鉴定 | 第82页 |
| 2.2 扬州鹅IFN-α重组蛋白在细胞中的表达 | 第82-85页 |
| 2.2.1 重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α转染细胞 | 第82-84页 |
| 2.2.1.1 提取重组pcDNA3.1-GoIFN-α的质粒 | 第82-83页 |
| 2.2.1.2 细胞的制备 | 第83页 |
| 2.2.1.3 转染细胞 | 第83-84页 |
| 2.2.2 pcDNA3.1-GoIFN-α表达情况检测 | 第84-85页 |
| 2.3 扬州鹅重组pcDNA3.1-GoIFN-α抗VSV活性检测 | 第85-87页 |
| 2.3.1 鹅胚成纤维细胞的制备 | 第85页 |
| 2.3.2 水疱性口炎病毒的扩增与保存 | 第85页 |
| 2.3.3 VSV效价的测定 | 第85-86页 |
| 2.3.4 重组扬州鹅IFN-a抗病毒活性测定 | 第86-87页 |
| 3 结果 | 第87-90页 |
| 3.1 重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α的鉴定 | 第87-88页 |
| 3.2 扬州鹅IFN-α基因在GEFs中的表达检测 | 第88页 |
| 3.3 扬州鹅IFN-α抗VSV病毒活性检测 | 第88-90页 |
| 4 讨论 | 第90-91页 |
| 4.1 扬州鹅IFN-α外源基因在鹅成纤维细胞中的表达 | 第90页 |
| 4.2 干扰素的抗病毒活性检测 | 第90-91页 |
| 结论 | 第91-93页 |
| 参考文献 | 第93-101页 |
| 作者简介 | 第101-102页 |
| 致谢 | 第102页 |
