| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-18页 |
| 1.1 抗菌肽相关研究进展 | 第10-13页 |
| 1.1.1 抗菌肽的发现及分类 | 第10页 |
| 1.1.2 抗菌肽的结构特点及其作用机制 | 第10-11页 |
| 1.1.3 抗菌肽存在的问题及应用前景 | 第11-12页 |
| 1.1.4 天蚕素抗菌肽的研究现状 | 第12-13页 |
| 1.2 植物生物反应器的研究进展 | 第13-16页 |
| 1.2.1 利用植物反应器生产药用蛋白的优点及研究进展 | 第13-14页 |
| 1.2.2 植物生物反应器的类型 | 第14-15页 |
| 1.2.3 植物生物反应器存在的问题及解决策略 | 第15页 |
| 1.2.4 植物生物反应器的展望 | 第15-16页 |
| 1.3 本研究的目的和意义 | 第16-17页 |
| 1.4 实验技术路线 | 第17-18页 |
| 第二章 Shiva-2 在烟草中的表达 | 第18-39页 |
| 2.1 主要实验材料 | 第18-20页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第18页 |
| 2.1.2 目的基因、菌株和质粒 | 第18页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第18页 |
| 2.1.4 主要试剂及相关配方 | 第18-20页 |
| 2.2 实验方法 | 第20-31页 |
| 2.2.1 CecrinB 基因的突变体 Shiva-2 的设计 | 第21-22页 |
| 2.2.2 Shiva-2 基因植物表达载体的构建 | 第22-26页 |
| 2.2.3 三亲交配法将载体 pPZP211-Shiva-2 导入农杆菌 | 第26-27页 |
| 2.2.4 烟草的种植与瞬时表达 | 第27-28页 |
| 2.2.5 表达蛋白的提取 | 第28页 |
| 2.2.6 目标蛋白生物活性检测 | 第28-29页 |
| 2.2.7 蛋白粗提液的 SDS-PAGE、Western Blotting 分析 | 第29-30页 |
| 2.2.8 表达蛋白 Shiva-2 的纯化与 SDS-PAGE 分析 | 第30-31页 |
| 2.3 结果与分析 | 第31-36页 |
| 2.3.1 Shiva-2 基因片段的酶切 | 第31页 |
| 2.3.2 中间克隆载体 pUC18-Shiva-2 的酶切鉴定 | 第31-32页 |
| 2.3.3 植物表达载体 pPZP211-Shiva-2 的构建 | 第32-33页 |
| 2.3.4 重组质粒转化根癌农杆菌的鉴定分析 | 第33-34页 |
| 2.3.5 蛋白粗提液生物活性的检测 | 第34-35页 |
| 2.3.6 SDS-PAGE 与 Western Blotting 分析 | 第35-36页 |
| 2.3.7 表达蛋白 Shiva-2 的纯化与 SDS-PAGE 分析 | 第36页 |
| 2.4 讨论 | 第36-38页 |
| 2.4.1 抗菌肽 Shiva-2 的选择及全基因合成 | 第36页 |
| 2.4.2 双元穿梭载体 pPZP211 的选择 | 第36页 |
| 2.4.3 表达载体转化农杆菌后的鉴定 | 第36-37页 |
| 2.4.4 影响 Shiva-2 基因在烟草中表达的因素分析 | 第37页 |
| 2.4.5 需要进一步改进的问题 | 第37-38页 |
| 2.5 小结 | 第38-39页 |
| 第三章 Shiva-2 在大肠杆菌 BL21 中的表达 | 第39-48页 |
| 3.1 主要实验材料 | 第39-40页 |
| 3.1.1 目的基因、菌株与质粒 | 第39页 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 | 第39页 |
| 3.1.3 培养基、缓冲液及其他溶液配方 | 第39-40页 |
| 3.2 实验方法 | 第40-43页 |
| 3.2.1 原核表达载体 pET28a-Shiva-2 的构建 | 第40-41页 |
| 3.2.2 重组质粒对表达宿主菌 BL21 的转化及鉴定 | 第41-42页 |
| 3.2.3 重组菌株 pET28a-Shiva-2 的诱导表达及生长曲线的测定 | 第42页 |
| 3.2.4 Tricine- SDS-PAGE 和 Western Blotting 分析 | 第42-43页 |
| 3.3 结果与分析 | 第43-46页 |
| 3.3.1 表达载体 pET-28a-Shiva-2 的构建 | 第43-45页 |
| 3.3.2 重组菌株 pET28a-Shiva-2 的诱导表达及生长曲线的测定 | 第45-46页 |
| 3.3.3 表达产物的 Tricine-SDS-PAGE 分析 | 第46页 |
| 3.4 讨论 | 第46-47页 |
| 3.4.1 原核表达载体的选择 | 第46-47页 |
| 3.4.2 影响 Shiva-2 基因在 E.coli 中表达的因素分析 | 第47页 |
| 3.4.3 需要进一步改进的问题 | 第47页 |
| 3.5 小结 | 第47-48页 |
| 第四章 叶绿体表达载体 pSK-PAT 的构建 | 第48-56页 |
| 4.1 材料 | 第48页 |
| 4.2 实验方法 | 第48-52页 |
| 4.2.1 烟草基因组的提取 | 第50页 |
| 4.2.2 烟草启动子（PrbcL）和终止子（Trps16）的克隆 | 第50-51页 |
| 4.2.3 中间克隆载体 pKS-P 的构建 | 第51页 |
| 4.2.4 中间克隆载体 pKS-PS 的构建 | 第51-52页 |
| 4.2.5 克隆载体 pKS-PST 的构建 | 第52页 |
| 4.3 结果与分析 | 第52-54页 |
| 4.3.1 烟草基因组的提取及 PCR 分别扩增 PrbcL 和 Trps16 | 第52页 |
| 4.3.2 重组质粒 T19-PrbcL 和 T19-Trps16 的构建 | 第52-53页 |
| 4.3.3 中间克隆载体 pKS-P 的构建 | 第53页 |
| 4.3.4 中间克隆载体 pKS-PS 的构建 | 第53-54页 |
| 4.3.5 载体 pKS-PST 的构建 | 第54页 |
| 4.4 讨论 | 第54-55页 |
| 4.4.1 叶绿体表达载体的选择 | 第54页 |
| 4.4.2 载体构建失败原因分析 | 第54-55页 |
| 4.4.3 下一步工作设想 | 第55页 |
| 4.5 小结 | 第55-56页 |
| 第五章 结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 作者简介 | 第62页 |
