| 摘要 | 第10-12页 |
| ABSTRACT | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第14-29页 |
| 1.1 禽白血病 | 第14-21页 |
| 1.1.1 病原特性 | 第14-17页 |
| 1.1.1.1 分型 | 第14-15页 |
| 1.1.1.2 形态学特征 | 第15-16页 |
| 1.1.1.3 理化特征 | 第16页 |
| 1.1.1.4 基因组结构 | 第16-17页 |
| 1.1.2 致病机制 | 第17-19页 |
| 1.1.2.1 分子感染机制 | 第17-19页 |
| 1.1.2.2 致肿瘤机制 | 第19页 |
| 1.1.3 流行病学 | 第19-21页 |
| 1.1.2.1 流行特征 | 第19-20页 |
| 1.1.2.2 流行现状 | 第20-21页 |
| 1.2 P53 | 第21-28页 |
| 1.2.1 p53发现过程 | 第21页 |
| 1.2.2 p53基因结构 | 第21-22页 |
| 1.2.3 p53蛋白结构 | 第22-23页 |
| 1.2.4 p53的功能 | 第23-25页 |
| 1.2.4.1 阻滞细胞周期 | 第24页 |
| 1.2.4.2 促进细胞凋亡 | 第24页 |
| 1.2.4.3 维持基因组稳定 | 第24-25页 |
| 1.2.4.4 抑制肿瘤血管生成 | 第25页 |
| 1.2.5 p53突变 | 第25-26页 |
| 1.2.5.1 P53突变类型 | 第25页 |
| 1.2.5.2 p53突变后功能变化 | 第25-26页 |
| 1.2.6 p53蛋白的临床意义 | 第26-27页 |
| 1.2.7 p53抗体的临床意义 | 第27-28页 |
| 1.3 研究目的及意义 | 第28-29页 |
| 2 材料与方法 | 第29-53页 |
| 2.1 试验材料 | 第29-32页 |
| 2.1.1 细胞和病毒 | 第29页 |
| 2.1.2 质粒 | 第29-30页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第30-31页 |
| 2.1.4 试验仪器和设备 | 第31-32页 |
| 2.2 试验方法 | 第32-53页 |
| 2.2.1 试剂配制 | 第32-33页 |
| 2.2.2 病毒液准备 | 第33-35页 |
| 2.2.2.1 DF-1细胞复苏 | 第33-34页 |
| 2.2.2.2 DF-1细胞的传代培养 | 第34页 |
| 2.2.2.3 病毒的增殖 | 第34页 |
| 2.2.2.4 病毒的TCID_(50)测定 | 第34-35页 |
| 2.2.3 引物设计与合成 | 第35-37页 |
| 2.2.4 质粒重组与提取 | 第37-42页 |
| 2.2.4.1 真核表达质粒pEGFP-C1-p53的构建 | 第37页 |
| 2.2.4.2 PCR产物胶回收 | 第37-38页 |
| 2.2.4.3 目的基因片段和pEGFP-C1载体的双酶切以及回收纯化 | 第38页 |
| 2.2.4.4 酶切产物的回收 | 第38页 |
| 2.2.4.5 酶切产物的连接 | 第38-39页 |
| 2.2.4.6 重组质粒的转化 | 第39页 |
| 2.2.4.7 重组质粒的菌液PCR鉴定 | 第39-40页 |
| 2.2.4.8 质粒的粗制 | 第40页 |
| 2.2.4.9 质粒的纯化 | 第40-41页 |
| 2.2.4.10 内毒素的清除 | 第41页 |
| 2.2.4.11 pEGFP-C1-p53质粒酶切鉴定 | 第41-42页 |
| 2.2.5 重组质粒转染CEF细胞 | 第42-43页 |
| 2.2.5.1 CEF细胞的制备 | 第42-43页 |
| 2.2.5.2 CEF细胞的转染 | 第43页 |
| 2.2.6 转染重组质粒后的CEF细胞内p53蛋白表达的荧光鉴定及目的蛋白获取 | 第43-44页 |
| 2.2.7 转染重组质粒后的CEF细胞内p53蛋白表达的Westernblot鉴定 | 第44-46页 |
| 2.2.8 激光共聚焦检测p53在CEF中表达定位 | 第46-47页 |
| 2.2.8.1 细胞爬片的制作 | 第46页 |
| 2.2.8.2 细胞封片及激光共聚焦仪器检测 | 第46-47页 |
| 2.2.9 荧光定量PCR检测肿瘤相关基因 | 第47-48页 |
| 2.2.9.1 样品处理与RNA提取 | 第47页 |
| 2.2.9.2 样品反转录 | 第47-48页 |
| 2.2.9.3 荧光定量PCR | 第48页 |
| 2.2.10 绝对荧光定量PCR检测病毒拷贝数 | 第48-51页 |
| 2.2.10.1 建立标准曲线 | 第48-51页 |
| 2.2.10.2 转染质粒与感染病毒 | 第51页 |
| 2.2.10.3 样品处理与绝对荧光定量 | 第51页 |
| 2.2.11 动物试验 | 第51-53页 |
| 2.2.11.1 动物试验设计 | 第51页 |
| 2.2.11.2 p53抗体检测 | 第51-52页 |
| 2.2.11.3 p53蛋白检测 | 第52页 |
| 2.2.11.4 数据处理 | 第52页 |
| 2.2.11.5 p53基因突变率检测 | 第52-53页 |
| 3 结果 | 第53-61页 |
| 3.1 病毒的TCID_(50)检测 | 第53页 |
| 3.2 PEGFP-C1-P53重组质粒酶切鉴定 | 第53-54页 |
| 3.3 PEGFP-C1-P53蛋白的表达鉴定与纯化 | 第54-56页 |
| 3.3.1 pEGFP-C1-p53蛋白的免疫荧光检测 | 第54页 |
| 3.3.2 pEGFP-C1-p53在CEF中过表达检测 | 第54-55页 |
| 3.3.3 pEGFP-C1-p53蛋白的Westernblot检测 | 第55-56页 |
| 3.3.4 激光共聚焦检测p53在CEF细胞中的表达定位情况 | 第56页 |
| 3.4 PEGFP-C1-P53蛋白在CEF细胞中过表达后对肿瘤相关基因的影响 | 第56-57页 |
| 3.5 PEGFP-C1-P53蛋白在CEF细胞中过表达后对ALV-J病毒在细胞中复制的影响 | 第57-58页 |
| 3.5.1 ALV-Jpol基因标准曲线的构建 | 第57页 |
| 3.5.2 病毒拷贝数检测结果 | 第57-58页 |
| 3.6 雏鸡感染ALV-J后P53抗原抗体变化及基因突变情况 | 第58-61页 |
| 3.6.1 动态检测鸡血清p53抗体变化情况 | 第58-59页 |
| 3.6.2 动态监测p53抗原变化情况 | 第59页 |
| 3.6.3 感染鸡p53基因突变情况检测 | 第59-61页 |
| 4 讨论 | 第61-63页 |
| 4.1 突变型P53致瘤可能与引起癌基因表达升高与抑癌基因表达降低表达有关 | 第61页 |
| 4.2 野生型P53蛋白过表达抑制ALV-J在CEF细胞的复制 | 第61-62页 |
| 4.3 P53抗原抗体水平升高作为ALV-J潜在的肿瘤早期标志 | 第62-63页 |
| 5 结论 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-73页 |
| 致谢 | 第73-75页 |
| 附录 | 第75页 |
