| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 引言 | 第13-28页 |
| 1 银耳的介绍 | 第13-15页 |
| 1.1 银耳的分类地位及生物学特性 | 第13-14页 |
| 1.2 银耳的生活史 | 第14页 |
| 1.3 银耳的营养价值 | 第14页 |
| 1.4 银耳的研究进展 | 第14-15页 |
| 2 cDNA文库构建 | 第15-17页 |
| 2.1 cDNA文库的概念与意义 | 第15页 |
| 2.2 构建cDNA文库的过程 | 第15-17页 |
| 2.3 构建cDNA文库的方法 | 第17页 |
| 2.3.1 固相cDNA文库法 | 第17页 |
| 2.3.2 Oligo-capping法 | 第17页 |
| 2.3.3 SMART法 | 第17页 |
| 3 密码子用法偏性分析 | 第17-20页 |
| 3.1 密码子使用偏好性 | 第17-18页 |
| 3.2 密码子使用偏好性的应用 | 第18-19页 |
| 3.3 密码子偏好性分析方法 | 第19-20页 |
| 3.3.1 相对同义密码子使用度 | 第19页 |
| 3.3.2 同义密码子相对使用频率 | 第19页 |
| 3.3.3 密码子适应指数 | 第19-20页 |
| 3.3.4 有效密码子数 | 第20页 |
| 4 食用菌启动子的研究进展 | 第20-23页 |
| 4.1 启动子的特征 | 第21页 |
| 4.1.1 真核启动子的结构 | 第21页 |
| 4.1.2 增强子 | 第21页 |
| 4.2 应用于食用菌载遗传转化的启动子 | 第21-22页 |
| 4.3 克隆启动子的方法 | 第22-23页 |
| 4.3.1 启动子探针质粒载体筛选 | 第22页 |
| 4.3.2 利用PCR技术克隆启动子 | 第22-23页 |
| 5 食用菌遗传转化的研究 | 第23-27页 |
| 5.1 遗传转化方法 | 第23-25页 |
| 5.1.1 CaCl_2-PEG介导的遗传转化 | 第23-24页 |
| 5.1.2 电激介导的遗传转化 | 第24页 |
| 5.1.3 基因枪遗传转化 | 第24页 |
| 5.1.4 限制性内切酶介导的遗传转化 | 第24-25页 |
| 5.1.5 农杆菌介导的遗传转化法 | 第25页 |
| 5.2 遗传选择标记 | 第25-26页 |
| 5.2.1 营养缺陷型标记 | 第25页 |
| 5.2.2 药物抗性标记 | 第25-26页 |
| 5.3 基因表达产物的检测 | 第26-27页 |
| 5.3.1 外源基因转录产物的检测 | 第26页 |
| 5.3.2 报告基因的酶法检测 | 第26页 |
| 5.3.3 免疫学检测 | 第26页 |
| 5.3.4 表达产物生物活性检测 | 第26-27页 |
| 6 本研究的目的与意义 | 第27-28页 |
| 第一章 银耳芽孢cDNA文库的建立 | 第28-43页 |
| 1 材料 | 第28页 |
| 1.1 菌株 | 第28页 |
| 1.2 培养基 | 第28页 |
| 1.3 试剂 | 第28页 |
| 2 方法 | 第28-35页 |
| 2.1 Total RNA的提取 | 第28-29页 |
| 2.2 Poly(A)+RNA的精制 | 第29-30页 |
| 2.3 cDNA的合成 | 第30-31页 |
| 2.3.1 cDNA第一条链的合成 | 第30页 |
| 2.3.2 cDNA第二条链的合成 | 第30-31页 |
| 2.4 粘性末端连接 | 第31页 |
| 2.5 磷酸化 | 第31-32页 |
| 2.6 限制酶XhoI酶切反应 | 第32页 |
| 2.7 去除短链cDNA | 第32-33页 |
| 2.8 与载体连接 | 第33页 |
| 2.9 转化到大肠杆菌感受态细胞中 | 第33-34页 |
| 2.10 插入片段大小的验证 | 第34页 |
| 2.11 库容的计算 | 第34页 |
| 2.12 全长cDNA的测序与分析 | 第34-35页 |
| 3 结果与分析 | 第35-41页 |
| 3.1 总RNA的提取 | 第35-36页 |
| 3.1.1 总RNA的均一性 | 第35页 |
| 3.1.2 总RNA的完整性 | 第35-36页 |
| 3.2 mRNA的纯化 | 第36页 |
| 3.3 cDNA的合成 | 第36-37页 |
| 3.3.1 双链cDNA的合成 | 第36页 |
| 3.3.2 短片段cDNA的去除 | 第36-37页 |
| 3.4 插入片段大小的验证 | 第37-38页 |
| 3.5 库容 | 第38页 |
| 3.6 全长cDNA序列分析 | 第38-41页 |
| 4 讨论 | 第41-43页 |
| 4.1 RNA质量 | 第41页 |
| 4.2 文库质量 | 第41-42页 |
| 4.3 cDNA序列分析 | 第42-43页 |
| 第二章 银耳密码子偏好性分析 | 第43-56页 |
| 1 材料 | 第43页 |
| 2 方法 | 第43-45页 |
| 2.1 银耳芽孢蛋白编码序列的获取 | 第43页 |
| 2.2 高频密码子分析法 | 第43-44页 |
| 2.2.1 银耳芽孢同义密码子用法分析 | 第43页 |
| 2.2.2 银耳芽孢高频密码子的确定 | 第43-44页 |
| 2.2.3 银耳芽孢和其他几种生物密码子偏好性比较 | 第44页 |
| 2.3 高表达密码子分析法 | 第44-45页 |
| 2.3.1 密码子有效数的计算 | 第44页 |
| 2.3.2 同义密码子相对使用度的计算 | 第44页 |
| 2.3.3 高表达优越密码子的确定 | 第44-45页 |
| 3 结果与分析 | 第45-53页 |
| 3.1 高频密码子分析法 | 第45-50页 |
| 3.1.1 高频密码子的确定 | 第45-47页 |
| 3.1.2 银耳与其他生物密码子偏好性比较 | 第47-49页 |
| 3.1.3 银耳、酿酒酵母与其他生物密码子使用频率比值的比较 | 第49-50页 |
| 3.2 高表达优越密码子分析法 | 第50-53页 |
| 3.2.1 高、低表达基因样本组的抽取 | 第50-51页 |
| 3.2.2 高表达优越密码子的确定 | 第51-53页 |
| 3.2.3 高、低表达样本组的密码子偏好性的比较 | 第53页 |
| 4 讨论 | 第53-56页 |
| 4.1 高频密码子分析法 | 第53-54页 |
| 4.2 高表达优越密码子分析法 | 第54-56页 |
| 第三章 银耳启动子的克隆及功能验证 | 第56-92页 |
| 1 材料 | 第56-58页 |
| 1.1 菌种 | 第56-57页 |
| 1.2 培养基 | 第57页 |
| 1.3 主要试剂 | 第57-58页 |
| 1.4 主要仪器 | 第58页 |
| 1.5 引物 | 第58页 |
| 2 方法 | 第58-68页 |
| 2.1 银耳高表达基因的筛选 | 第58-59页 |
| 2.2 银耳启动子的克隆 | 第59-62页 |
| 2.2.1 银耳芽孢总DNA的提取 | 第59页 |
| 2.2.2 银耳G06、C02、E02三个基因上游片段的克隆 | 第59-61页 |
| 2.2.3 目的片段的回收 | 第61页 |
| 2.2.4 目的片段与载体连接 | 第61页 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第61页 |
| 2.2.6 转化子验证及测序 | 第61-62页 |
| 2.2.7 序列分析 | 第62页 |
| 2.3 表达载体构建 | 第62-66页 |
| 2.3.1 质粒提取 | 第62页 |
| 2.3.2 pBHg-E02表达载体构建 | 第62-64页 |
| 2.3.3 pBHg-G06表达载体构建 | 第64-66页 |
| 2.3.4 pBHg-C02表达载体构建 | 第66页 |
| 2.4 银耳启动子的验证 | 第66-68页 |
| 2.4.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备 | 第66页 |
| 2.4.2 冻融法转化农杆菌 | 第66页 |
| 2.4.3 农杆菌菌落PCR | 第66-67页 |
| 2.4.4 农杆菌介导潮霉素基因转化银耳芽孢 | 第67页 |
| 2.4.5 银耳转化子的验证 | 第67-68页 |
| 3 结果与分析 | 第68-89页 |
| 3.1 高表达量基因的筛选 | 第68-71页 |
| 3.2 银耳启动子的克隆 | 第71-75页 |
| 3.2.1 银耳芽孢总DNA的提取 | 第71-72页 |
| 3.2.2 银耳G06、C02、E02三个基因上游片段的克隆 | 第72-73页 |
| 3.2.3 序列分析 | 第73-75页 |
| 3.3 表达载体构建 | 第75-83页 |
| 3.3.1 pBHg-E02表达载体构建 | 第77-81页 |
| 3.3.2 pBHg-G06和pBHg-C02表达载体构建 | 第81-83页 |
| 3.4 银耳启动子的验证 | 第83-89页 |
| 3.4.1 重组质粒转化农杆菌 | 第83-84页 |
| 3.4.2 农杆菌菌落PCR验证 | 第84-86页 |
| 3.4.3 农杆菌介导潮霉素基因转化银耳芽孢 | 第86页 |
| 3.4.4 银耳转化子验证 | 第86-89页 |
| 4 讨论 | 第89-92页 |
| 4.1 高表达基因的筛选 | 第89页 |
| 4.2 银耳启动子克隆 | 第89页 |
| 4.3 启动子序列分析 | 第89-90页 |
| 4.4 载体构建 | 第90-91页 |
| 4.5 银耳启动子的验证 | 第91-92页 |
| 结论 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-100页 |
| 附录 | 第100-110页 |
| 致谢 | 第110页 |
