| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略词表 | 第11-12页 |
| 一、前言 | 第12-25页 |
| 1.粒细胞巨噬细胞集落刺激因子研究进展 | 第12-18页 |
| ·粒细胞巨噬细胞集落刺激因子历史背景 | 第12-13页 |
| ·粒细胞巨噬细胞集落刺激因子生物学特性 | 第13-16页 |
| ·粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的应用 | 第16-18页 |
| ·作为DNA疫苗佐剂 | 第16页 |
| ·GM-CSF的临床应用 | 第16-18页 |
| 2.巴斯德毕赤酵母表达系统研究现状 | 第18-23页 |
| ·宿主菌 | 第18-19页 |
| ·表达载体种类 | 第19页 |
| ·巴斯德毕赤酵母中外源蛋白的表达 | 第19-22页 |
| ·巴斯德毕赤酵母外源蛋白表达特点 | 第19-20页 |
| ·巴斯德毕赤酵母外源蛋白表达水平 | 第20-22页 |
| ·糖基化对外源蛋白结构与功能的影响 | 第22页 |
| ·应用前景及展望 | 第22-23页 |
| 3.TF-1细胞研究概况 | 第23页 |
| 4.本研究目的与意义 | 第23-25页 |
| 二、实验部分 | 第25-58页 |
| 1.材料 | 第25-27页 |
| ·菌株与载体 | 第25页 |
| ·主要试剂 | 第25-26页 |
| ·自备试剂 | 第25页 |
| ·生物学试剂 | 第25-26页 |
| ·主要仪器 | 第26-27页 |
| 2.方法 | 第27-40页 |
| ·引物设计 | 第27页 |
| ·pGM-CSF基因的扩增及回收 | 第27-29页 |
| ·PCR扩增模板19T-GM质粒抽提 | 第27-28页 |
| ·pGM-CSF基因的PCR扩增 | 第28-29页 |
| ·pGM-CSF基因的回收 | 第29页 |
| ·pGM-CSF基因的克隆及鉴定 | 第29-32页 |
| ·DH5α感受态细胞的制备 | 第29-30页 |
| ·pGM-CSF连接及转化 | 第30-31页 |
| ·阳性转化子的鉴定 | 第31-32页 |
| ·毕赤酵母表达载体pPIC9K-pGM的构建及鉴定 | 第32-33页 |
| ·pMD19-T-pGM基因酶切及回收 | 第32页 |
| ·连接及转化 | 第32页 |
| ·阳性转化子的鉴定 | 第32-33页 |
| ·重组表达载体pPIC9K-pGM质粒的转化 | 第33-35页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第33页 |
| ·重组表达载体线性化 | 第33-34页 |
| ·线性化载体质粒的电转化 | 第34-35页 |
| ·毕赤酵母重组子GS115/pPIC9K-pGM的筛选与鉴定 | 第35-37页 |
| ·高拷贝重组子的抗性筛选 | 第35页 |
| ·Mut~+和Mut~s表型鉴定 | 第35-36页 |
| ·重组子PCR鉴定 | 第36-37页 |
| ·GS115/pPIC9K-pGM的诱导表达产物的间接ELISA分析检测 | 第37-38页 |
| ·GS115/pPIC9K-pGM的诱导表达 | 第37页 |
| ·诱导表达时间的优化 | 第37页 |
| ·GS115/pPIC9K-pGM的诱导表达产物的间接ELISA检测 | 第37-38页 |
| ·GS115/pPIC9K-pGM诱导表达产物的SDS-PAGE检测 | 第38-39页 |
| ·三氯乙酸沉淀样品 | 第38页 |
| ·SDS-PAGE检测 | 第38-39页 |
| ·GS115/pPIC9K-pGM的诱导表达产物western blotting鉴定 | 第39页 |
| ·GS115/pPIC9K-pGM的诱导表达产物活性检测 | 第39-40页 |
| 3 结果 | 第40-51页 |
| ·pGM-CSF基因扩增结果 | 第40页 |
| ·pGM-CSF基因克隆及鉴定 | 第40-44页 |
| ·pGM-CSF克隆载体的PCR和酶切鉴定 | 第40-41页 |
| ·pGM-CSF克隆载体序列分析 | 第41页 |
| ·pGM-CSF氨基酸序列分析结果 | 第41-42页 |
| ·pGM-CSF二级结构预测分析结果 | 第42页 |
| ·pGM-CSF三维结构预测结果 | 第42-43页 |
| ·pGM-CSF同源性比较与遗传进化分析结果 | 第43-44页 |
| ·pGM-CSF蛋白糖基化位点预测分析 | 第44页 |
| ·毕赤酵母表达载体pPIC9K-pGM的构建及鉴定 | 第44-45页 |
| ·毕赤酵母重组子GS115/pPIC9K-pGM的筛选与鉴定 | 第45-46页 |
| ·高拷贝重组子的抗性筛选 | 第45页 |
| ·Mut~+和Mut~s表型鉴定 | 第45-46页 |
| ·重组子PCR鉴定 | 第46页 |
| ·GS115/pPIC9K-pGM诱导表达产物的间接ELISA分析 | 第46-48页 |
| ·GS115/pPIC9K-pGM的诱导表达产物SDS-PAGE分析 | 第48-49页 |
| ·初步诱导表达 | 第48页 |
| ·诱导时间的优化 | 第48-49页 |
| ·GS115/pPIC9K-pGM的诱导表达产物western-blotting分析 | 第49-50页 |
| ·GS115/pPIC9K-pGM的诱导表达产物活性检测分析 | 第50-51页 |
| 4 讨论 | 第51-57页 |
| ·表达系统的选择 | 第51-52页 |
| ·高拷贝重组菌株的筛选 | 第52-53页 |
| ·表达产物的检测 | 第53-54页 |
| ·影响pGM-CSF蛋白表达量的因素 | 第54-55页 |
| ·pGM-CSF蛋白的活性检测 | 第55-57页 |
| 5 结论 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-63页 |
| 致谢 | 第63-65页 |
| 附录 | 第65-68页 |
