| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章：文献综述 | 第12-22页 |
| 1.1 CVH基因概述 | 第12-13页 |
| 1.2 DEAD-box蛋白家族简介 | 第13-17页 |
| 1.2.1 DEAD-box蛋白家族的结构 | 第13-14页 |
| 1.2.2 DEAD-box蛋白家族的生物学功能 | 第14-17页 |
| 1.3 VASA基因的简介 | 第17-19页 |
| 1.4 鸡原始生殖细胞和CVH基因 | 第19-20页 |
| 1.5 研究目的及意义 | 第20-21页 |
| 1.6 研究路线 | 第21-22页 |
| 第二章：鸡CVH基因片段的克隆及其序列分析 | 第22-40页 |
| 2.1 引言 | 第22页 |
| 2.2 材料和方法 | 第22-32页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第22-24页 |
| 2.2.1.1 实验动物 | 第22-23页 |
| 2.2.1.2 菌种及所用质粒 | 第23页 |
| 2.2.1.3 主要实验仪器设备 | 第23页 |
| 2.2.1.4 主要实验试剂 | 第23页 |
| 2.2.1.5 常用溶液 | 第23-24页 |
| 2.2.2 鸡CVH基因片段的克隆 | 第24-28页 |
| 2.2.2.1 鸡CVH基因截取片段的选择 | 第24页 |
| 2.2.2.2 目的基因片段的引物设计 | 第24-25页 |
| 2.2.2.3 鸡睾丸总RNA提取(Trizol法) | 第25页 |
| 2.2.2.4 RT-PCR获取cDNA | 第25-26页 |
| 2.2.2.5 目的基因片段的扩增 | 第26-27页 |
| 2.2.2.6 PCR扩增产物的胶回收和纯化 | 第27-28页 |
| 2.2.3 构建pMD18-T-CVH重组克隆载体 | 第28-32页 |
| 2.2.3.1 胶回收目的基因片段与pMD18-T质粒双酶切 | 第28-29页 |
| 2.2.3.2 pMD18-T质粒双酶切产物胶回收 | 第29页 |
| 2.2.3.3 CVH基因片段与pMD18-T质粒连接 | 第29-30页 |
| 2.2.3.4 重组pMD18-T-CVH质粒转化DH5α感受态及阳性克隆鉴定 | 第30页 |
| 2.2.3.5 抽提重组pMD18-T-CVH质粒 | 第30-31页 |
| 2.2.3.6 重组pMD18-T-CVH质粒双酶切鉴定 | 第31-32页 |
| 2.2.3.7 重组pMD18-T-CVH质粒测序及其序列分析 | 第32页 |
| 2.3 结果与分析 | 第32-39页 |
| 2.3.1 PCR从鸡睾丸cDNA中扩增目的片段 | 第32页 |
| 2.3.2 E.coli DH5α菌液PCR鉴定 | 第32-34页 |
| 2.3.3 pMD18-T-CVH重组质粒双酶切鉴定 | 第34页 |
| 2.3.4 重组质粒测序结果和序列分析 | 第34-36页 |
| 2.3.5 氨基酸序列同源性 | 第36-37页 |
| 2.3.6 CVH基因编码多肽链信号肽分析 | 第37-38页 |
| 2.3.7 克隆片段编码多肽的抗原表位分析 | 第38-39页 |
| 2.4 讨论 | 第39页 |
| 2.5 小结 | 第39-40页 |
| 第三章 鸡CVH基因片段表达载体的构建及其多克隆抗体制备 | 第40-56页 |
| 3.1 引言 | 第40页 |
| 3.2 材料和方法 | 第40-49页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第40-41页 |
| 3.2.1.1 实验动物 | 第40页 |
| 3.2.1.2 菌种及所用质粒 | 第40-41页 |
| 3.2.1.3 主要实验仪器设备 | 第41页 |
| 3.2.1.4 主要实验试剂 | 第41页 |
| 3.2.1.5 常用溶液 | 第41页 |
| 3.2.2 pET-30a-CVH重组表达载体构建 | 第41-44页 |
| 3.2.2.1 pET-30a空载质粒双酶切 | 第41-42页 |
| 3.2.2.2 目的基因与pET-30a质粒双酶切产物的胶回收 | 第42页 |
| 3.2.2.3 CVH基因片段与pET-30a质粒连接 | 第42-43页 |
| 3.2.2.4 连接产物转化E.coli DH5α感受态及阳性克隆鉴定 | 第43页 |
| 3.2.2.5 抽提重组pET-30a-CVH质粒 | 第43页 |
| 3.2.2.6 重组pET-30a-CVH质粒双酶切鉴定 | 第43-44页 |
| 3.2.3 重组质粒pET-30a-CVH在E.coli BL21(DE3)中的诱导表达 | 第44-46页 |
| 3.2.3.1 pET-30a-CVH质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞 | 第44页 |
| 3.2.3.2 诱导pET-30a-CVH在大肠杆菌中表达 | 第44-45页 |
| 3.2.3.3 大肠杆菌的诱导表达产物SDS-PAGE检测 | 第45-46页 |
| 3.2.4 融合蛋白His-Cvh的亲和纯化 | 第46-47页 |
| 3.2.4.1 融合蛋白His-Cvh的可溶性鉴定 | 第46页 |
| 3.2.4.2 融合蛋白His-Cvh的纯化 | 第46-47页 |
| 3.2.5 Western blotting检测融合蛋白 | 第47-48页 |
| 3.2.6 Cvh多克隆抗体制备 | 第48-49页 |
| 3.2.6.1 免疫新西兰大白兔 | 第48-49页 |
| 3.2.6.2 CVH多克隆抗体特异性检测 | 第49页 |
| 3.2.6.2.1. CVH多抗与纯化蛋白特异性结合 | 第49页 |
| 3.2.6.2.2 CVH多抗与PGCs细胞内源性CVH蛋白特异性结合 | 第49页 |
| 3.3 结果与分析 | 第49-54页 |
| 3.3.1 重组质粒菌液PCR和双酶切鉴定 | 第49-50页 |
| 3.3.2 融合蛋白的原核表达与纯化 | 第50-52页 |
| 3.3.3 Western blot检测融合蛋白表达 | 第52页 |
| 3.3.4 Western blot检测多克隆抗体特异性 | 第52-54页 |
| 3.4 讨论 | 第54-55页 |
| 3.5 小结 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-60页 |
| 附录 | 第60-66页 |
| 1. 所用主要试剂的配制 | 第60-64页 |
| 2. 感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第64页 |
| 3. Ni-NTA亲和层析柱的再生 | 第64-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
