| 缩略词表 | 第4-5页 |
| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第12-18页 |
| 1.1 海参免疫及功能蛋白 | 第12页 |
| 1.2 溶菌酶的简介 | 第12-15页 |
| 1.2.1 溶菌酶的分类 | 第13页 |
| 1.2.2 溶菌酶的应用 | 第13-15页 |
| 1.3 过氧化氢酶简介 | 第15-16页 |
| 1.3.1 过氧化氢酶的类型划分 | 第15页 |
| 1.3.2 CAT的应用现状 | 第15-16页 |
| 1.4 研究内容、目的和意义 | 第16-18页 |
| 1.4.1 研究内容 | 第16-17页 |
| 1.4.2 研究目的和意义 | 第17-18页 |
| 第二章 材料、仪器及方法 | 第18-41页 |
| 2.1. 菌种与质粒 | 第18页 |
| 2.2. 试剂与工具酶 | 第18页 |
| 2.3 主要溶液及缓冲液 | 第18-21页 |
| 2.3.1 抗生素溶液 | 第18-19页 |
| 2.3.2 蛋白分离纯化常用溶液 | 第19页 |
| 2.3.3 氯化钙转化溶液 | 第19-20页 |
| 2.3.4 蛋白酶切缓冲液 | 第20页 |
| 2.3.5 琼脂糖凝胶电泳溶液 | 第20页 |
| 2.3.6 SDS-PAGE电泳溶液及缓冲液: | 第20-21页 |
| 2.4 实验用培养基 | 第21页 |
| 2.5 主要实验仪器 | 第21-22页 |
| 2.6 海参溶菌酶的组织分布 | 第22-25页 |
| 2.6.1 海参总RNA的提取 | 第22-23页 |
| 2.6.2 RNA反转录获取cDNA | 第23页 |
| 2.6.3 β-actin内参验证PCR | 第23-24页 |
| 2.6.4 荧光定量PCR | 第24-25页 |
| 2.7 灿烂弧菌刺激后海参溶菌酶的变化 | 第25页 |
| 2.8 海参体腔细胞中溶菌酶基因沉默 | 第25-27页 |
| 2.8.1 海参体腔细胞原代培养 | 第25-26页 |
| 2.8.2 体腔细胞基因沉默 | 第26-27页 |
| 2.9 海参溶菌酶蛋白的表达、纯化 | 第27-29页 |
| 2.10 重组蛋白肠激酶酶切、纯化 | 第29-30页 |
| 2.11 活性检测 | 第30页 |
| 2.12 加入海参溶菌酶后LPS刺激海参体腔细胞的凋亡和坏死 | 第30页 |
| 2.13 海参溶菌酶关键酶活位点分析 | 第30-31页 |
| 2.14 点突变,蛋白表达、肠激酶酶切及纯化 | 第31-33页 |
| 2.15 抑菌圈活性鉴定 | 第33页 |
| 2.16 异构肽酶活性研究 | 第33页 |
| 2.17 过氧化氢酶基因扩增与重组克隆 | 第33-36页 |
| 2.17.1 设计特异性引物 | 第33-34页 |
| 2.17.2 PCR扩增CAT基因 | 第34-35页 |
| 2.17.3 目的片段与载体的连接 | 第35页 |
| 2.17.4 重组质粒转化E.coli DH5α | 第35页 |
| 2.17.5 重组质粒的菌落PCR鉴定 | 第35-36页 |
| 2.18 构建大肠杆菌重组胞内表达载体 | 第36-39页 |
| 2.18.1 重组质粒的提取 | 第36页 |
| 2.18.2 根据特定要求设计特异性引物 | 第36页 |
| 2.18.3 PCR扩增CAT上和CAT基因片段 | 第36-37页 |
| 2.18.4 表达质粒的双酶切鉴定 | 第37-38页 |
| 2.18.5 低熔点琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物和双酶切产物 | 第38页 |
| 2.18.6 载体与目的片段的连接和转化 | 第38页 |
| 2.18.7 重组质粒的鉴定 | 第38-39页 |
| 2.18.8 重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3)及鉴定 | 第39页 |
| 2.19 重组pET28c(+)-CAT蛋白的诱导表达及条件的确定 | 第39-41页 |
| 2.19.1 诱导表达时间的确定 | 第39页 |
| 2.19.2 诱导物IPTG加入量的确定 | 第39页 |
| 2.19.3 温度的确定 | 第39-40页 |
| 2.19.4 pH的确定 | 第40页 |
| 2.19.5 转速的确定 | 第40页 |
| 2.19.6 SDS-PAGE检测 | 第40-41页 |
| 第三章 海参i型溶菌酶的组织分布及其在海参体腔细胞免疫应激过程中的作用 | 第41-49页 |
| 3.1 海参溶菌酶的组织分布 | 第41-43页 |
| 3.1.1 海参总RNA的提取及反转录 | 第41-42页 |
| 3.1.2 荧光定量PCR检测海参溶菌酶在各个组织的分布 | 第42-43页 |
| 3.2 检测海参溶菌酶在机体免疫刺激(灿烂弧菌)后的异常调节 | 第43-44页 |
| 3.3 加入海参溶菌酶后LPS刺激海参体腔细胞的凋亡和坏死 | 第44-45页 |
| 3.4 海参溶菌酶蛋白在体腔细胞免疫过程中具有重要作用 | 第45-47页 |
| 3.5 本章小结 | 第47-49页 |
| 第四章 海参i型溶菌酶的分离纯化、抑菌活性和异构肽酶活性鉴定及抑菌活性位点的分析、确定 | 第49-62页 |
| 4.1 非融合海参溶菌酶蛋白的分离纯化 | 第49-52页 |
| 4.1.1 重组海参溶菌酶蛋白的表达纯化 | 第49-50页 |
| 4.1.2 非融合海参溶菌酶的分离纯化 | 第50-52页 |
| 4.2 海参溶菌酶的酶活鉴定 | 第52-54页 |
| 4.2.1 海参溶菌酶的抑菌活性 | 第52页 |
| 4.2.2 海参溶菌酶的异构肽酶活性 | 第52-54页 |
| 4.3 海参溶菌酶抑菌活性关键酶活位点的分析 | 第54页 |
| 4.4 海参溶菌酶定点突变体的获得 | 第54-56页 |
| 4.5 海参溶菌酶突变体蛋白的表达 | 第56-58页 |
| 4.6 突变体非融合蛋白的分离、纯化 | 第58-59页 |
| 4.7 分析检测海参溶菌酶的活性位点 | 第59-61页 |
| 4.7.1 抑菌圈活性鉴定 | 第59-60页 |
| 4.7.2 异构肽酶活性测定 | 第60-61页 |
| 4.8 本章小结 | 第61-62页 |
| 第五章 过氧化氢酶原核表达载体的构建表达及诱导条件的优化 | 第62-70页 |
| 5.1 过氧化氢酶基因扩增与重组克隆 | 第62-63页 |
| 5.1.1 PCR扩增CAT基因 | 第62页 |
| 5.1.2 菌落PCR鉴定 | 第62-63页 |
| 5.2 构建大肠杆菌重组胞内表达载体 | 第63-66页 |
| 5.2.1 PCR扩增CAT上和CAT下基因片段 | 第63-64页 |
| 5.2.2 表达质粒的双酶切鉴定 | 第64页 |
| 5.2.3 重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3)及鉴定 | 第64-66页 |
| 5.3 基因工程菌(pET28c(+)-CAT/BL21(DE3)表达海参过氧化氢酶条件优化 | 第66-69页 |
| 5.3.1 诱导时间条件优化 | 第66页 |
| 5.3.2 诱导物IPTG量条件优化 | 第66-67页 |
| 5.3.3 温度的条件优化 | 第67-68页 |
| 5.3.4 pH的条件优化 | 第68页 |
| 5.3.5 转速的条件优化 | 第68-69页 |
| 5.4 本章小结 | 第69-70页 |
| 第六章 结论 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 附录 | 第75-77页 |
