| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| TABLE OF CONTENTS | 第15-21页 |
| 图目录 | 第21-24页 |
| 表目录 | 第24-25页 |
| 缩略词 | 第25-28页 |
| 1 绪论 | 第28-51页 |
| 1.1 上皮间质转化(EMT) | 第30-39页 |
| 1.1.1 EMT简介 | 第30-31页 |
| 1.1.2 E-cadherin | 第31-33页 |
| 1.1.3 EMT转录因子 | 第33-37页 |
| 1.1.4 EMT与TGF-β信号通路 | 第37-39页 |
| 1.1.5 EMT与乳腺癌 | 第39页 |
| 1.2 细胞命运决定因子DACH1概述 | 第39-49页 |
| 1.2.1 DACH1的发现 | 第39页 |
| 1.2.2 DACH1的结构 | 第39-41页 |
| 1.2.3 DACH1的翻译后修饰 | 第41页 |
| 1.2.4 DACH1与TGF-β/SMADs信号通路 | 第41-42页 |
| 1.2.5 DACH1与Cyclin D1介导的肿瘤细胞生长 | 第42-43页 |
| 1.2.6 DACH1与c-Jun介导的肿瘤细胞生长 | 第43页 |
| 1.2.7 DACH1与IL-8介导的乳腺癌的转移 | 第43-45页 |
| 1.2.8 DACH1与雌激素受体信号通路 | 第45-46页 |
| 1.2.9 DACH1与雄激素受体信号通路 | 第46-47页 |
| 1.2.10 DACH1与叉头蛋白信号通路 | 第47-48页 |
| 1.2.11 DACH1与p53介导的细胞周期停滞 | 第48-49页 |
| 1.2.12 DACH1与YB-1介导的癌基因的转录和翻译 | 第49页 |
| 1.3 本文选题依据和研究内容 | 第49-51页 |
| 1.3.1 选题依据 | 第49-50页 |
| 1.3.2 研究内容 | 第50-51页 |
| 2 DACH1对乳腺癌细胞形态及EMT的影响 | 第51-77页 |
| 2.1 引言 | 第51页 |
| 2.2 仪器与试剂 | 第51-54页 |
| 2.2.1 仪器 | 第51-52页 |
| 2.2.2 试剂 | 第52-53页 |
| 2.2.3 试剂配制 | 第53-54页 |
| 2.2.4 菌种、细胞及质粒 | 第54页 |
| 2.3 实验方法 | 第54-63页 |
| 2.3.1 pcDNA3.1-3×Flag-DACH1质粒构建 | 第54-56页 |
| 2.3.2 shDACH1质粒构建 | 第56-57页 |
| 2.3.3 质粒转化 | 第57-58页 |
| 2.3.4 质粒制备 | 第58页 |
| 2.3.5 质粒测序 | 第58页 |
| 2.3.6 细胞培养 | 第58页 |
| 2.3.7 细胞转染 | 第58-59页 |
| 2.3.8 细胞筛选 | 第59页 |
| 2.3.9 蛋白样品制备 | 第59页 |
| 2.3.10 蛋白浓度测定 | 第59页 |
| 2.3.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第59-60页 |
| 2.3.12 免疫印迹(western blot,WB) | 第60-61页 |
| 2.3.13 免疫荧光(immunofluorescence,IF) | 第61页 |
| 2.3.14 细胞克隆分散(cell colony scattering) | 第61-62页 |
| 2.3.15 细胞划痕(scratch wound-healing) | 第62页 |
| 2.3.16 侵袭小室(Transwell) | 第62-63页 |
| 2.3.17 细胞生长曲线测定(MTT法) | 第63页 |
| 2.3.18 统计学分析 | 第63页 |
| 2.4 实验结果与分析 | 第63-76页 |
| 2.4.1 DACH1对乳腺癌细胞形态的影响 | 第63-66页 |
| 2.4.2 DACH1对细胞迁移能力的影响 | 第66-68页 |
| 2.4.3 DACH1对细胞侵袭能力的影响 | 第68-70页 |
| 2.4.4 DACH1对细胞骨架的影响 | 第70-71页 |
| 2.4.5 DACH1对细胞增殖能力的影响 | 第71-72页 |
| 2.4.6 DACH1对EMT标志物蛋白表达的影响 | 第72-74页 |
| 2.4.7 DACH1对EMT标志物细胞定位的影响 | 第74-76页 |
| 2.5 讨论 | 第76页 |
| 2.6 本章小结 | 第76-77页 |
| 3 DACH1对E-cadherin的调控作用 | 第77-100页 |
| 3.1 引言 | 第77页 |
| 3.2 仪器与试剂 | 第77-81页 |
| 3.2.1 仪器 | 第77-78页 |
| 3.2.2 试剂 | 第78-79页 |
| 3.2.3 试剂配制 | 第79-81页 |
| 3.2.4 菌种、细胞及质粒 | 第81页 |
| 3.3 实验方法 | 第81-91页 |
| 3.3.1 细胞培养 | 第81页 |
| 3.3.2 基因组DNA制备 | 第81页 |
| 3.3.3 pGL3-E-cadherin-Luc质粒构建 | 第81-83页 |
| 3.3.4 pGL3-E-cadherin-E-box-mut-Luc质粒构建 | 第83-84页 |
| 3.3.5 pcDNA3.1-3×Flag-DACH1-△DBD质粒构建 | 第84页 |
| 3.3.6 cDNA样品制备 | 第84页 |
| 3.3.7 pEGFP-SNAI1和pcDNA3.1-HA-SNAI2质粒构建 | 第84-86页 |
| 3.3.8 质粒转化 | 第86页 |
| 3.3.9 质粒制备 | 第86页 |
| 3.3.10 质粒测序 | 第86页 |
| 3.3.11 细胞转染 | 第86页 |
| 3.3.12 RT-PCR | 第86-87页 |
| 3.3.13 荧光素酶报告基因 | 第87-88页 |
| 3.3.14 蛋白样品制备 | 第88页 |
| 3.3.15 蛋白浓度测定 | 第88页 |
| 3.3.16 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第88页 |
| 3.3.17 免疫印迹(western blot,WB) | 第88页 |
| 3.3.18 染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP) | 第88-91页 |
| 3.3.19 统计学分析 | 第91页 |
| 3.4 实验结果与分析 | 第91-97页 |
| 3.4.1 DACH1对E-cadherin mRNA水平的影响 | 第91-92页 |
| 3.4.2 DACH1对E-cadherin转录活性的影响 | 第92-93页 |
| 3.4.3 DACH1对E-box突变的E-cadherin转录活性的影响 | 第93-94页 |
| 3.4.4 DACH1对SNAI1蛋白表达的影响 | 第94-95页 |
| 3.4.5 DACH1结合在E-cadherin启动子E-box区域上 | 第95-96页 |
| 3.4.6 DACH1-△DBD对E-cadherin转录活性的影响 | 第96页 |
| 3.4.7 DACH1可能通过SNAI1影响E-cadherin转录活性 | 第96-97页 |
| 3.5 讨论 | 第97-99页 |
| 3.6 本章小结 | 第99-100页 |
| 4 DACH1与SNAI1之间相互作用的确定 | 第100-113页 |
| 4.1 引言 | 第100页 |
| 4.2 仪器与试剂 | 第100-103页 |
| 4.2.1 仪器 | 第100-101页 |
| 4.2.2 试剂 | 第101-102页 |
| 4.2.3 试剂配制 | 第102-103页 |
| 4.2.4 菌种、细胞及质粒 | 第103页 |
| 4.3 实验方法 | 第103-107页 |
| 4.3.1 pGEX-4T-3-SNAI1质粒构建 | 第103页 |
| 4.3.2 pACT-DACH1和pBIND-SNAI1质粒构建 | 第103-104页 |
| 4.3.3 质粒转化 | 第104页 |
| 4.3.4 质粒制备 | 第104页 |
| 4.3.5 质粒测序 | 第104页 |
| 4.3.6 细胞培养 | 第104页 |
| 4.3.7 细胞转染 | 第104页 |
| 4.3.8 蛋白样品制备 | 第104页 |
| 4.3.9 蛋白浓度测定 | 第104页 |
| 4.3.10 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,CoIP) | 第104-105页 |
| 4.3.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第105页 |
| 4.3.12 免疫印迹(western blot,WB) | 第105页 |
| 4.3.13 哺乳动物双杂交系统(mammalian two-hybrid system) | 第105页 |
| 4.3.14 GST-pulldown | 第105-107页 |
| 4.3.15 免疫荧光(immunofluorescence,IF) | 第107页 |
| 4.3.16 统计学分析 | 第107页 |
| 4.4 实验结果与分析 | 第107-111页 |
| 4.4.1 外源DACH1与SNAI1之间的相互作用 | 第107-109页 |
| 4.4.2 内源DACH1与SNAI1之间的相互作用 | 第109-110页 |
| 4.4.3 GST-pulldown实验确定DACH1与SNAI1之间的相互作用 | 第110-111页 |
| 4.4.4 DACH1与SNAI1在MCF-7细胞中的分布 | 第111页 |
| 4.5 讨论 | 第111-112页 |
| 4.6 本章小结 | 第112-113页 |
| 5 DACH1通过SNAI1对E-cadherin的调节作用 | 第113-124页 |
| 5.1 引言 | 第113页 |
| 5.2 仪器与试剂 | 第113-116页 |
| 5.2.1 仪器 | 第113-114页 |
| 5.2.2 试剂 | 第114-115页 |
| 5.2.3 试剂配制 | 第115页 |
| 5.2.4 菌种、细胞及质粒 | 第115-116页 |
| 5.3 实验方法 | 第116-117页 |
| 5.3.1 pCMV5-Myc-HDAC1质粒构建 | 第116页 |
| 5.3.2 质粒转化 | 第116页 |
| 5.3.3 质粒制备 | 第116页 |
| 5.3.4 质粒测序 | 第116页 |
| 5.3.5 细胞培养 | 第116页 |
| 5.3.6 细胞转染 | 第116页 |
| 5.3.7 细胞筛选 | 第116页 |
| 5.3.8 染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP) | 第116-117页 |
| 5.3.9 连续染色质免疫共沉淀(ChIP-reChIP) | 第117页 |
| 5.3.10 蛋白样品制备 | 第117页 |
| 5.3.11 蛋白浓度测定 | 第117页 |
| 5.3.12 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第117页 |
| 5.3.13 免疫印迹(western blot,WB) | 第117页 |
| 5.3.14 荧光素酶报告基因 | 第117页 |
| 5.3.15 侵袭小室(Transwell) | 第117页 |
| 5.3.16 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,CoIP) | 第117页 |
| 5.3.17 统计学分析 | 第117页 |
| 5.4 实验结果与分析 | 第117-123页 |
| 5.4.1 DACH1与SNAI1形成复合物结合在E-cadherin启动子区域 | 第117-118页 |
| 5.4.2 DACH1通过SNAI1结合在E-cadherin启动子区域 | 第118-119页 |
| 5.4.3 DACH1通过SNAI1影响E-cadherin转录活性 | 第119-120页 |
| 5.4.4 DACH1通过SNAI1影响细胞侵袭能力 | 第120-121页 |
| 5.4.5 DACHl通过SNAI1影响E-cadherin蛋白表达 | 第121-122页 |
| 5.4.6 DACH1对HDAC1与SNAI1相互作用的影响 | 第122-123页 |
| 5.5 讨论 | 第123页 |
| 5.6 本章小结 | 第123-124页 |
| 6 DACH1对乳腺癌转移的影响 | 第124-135页 |
| 6.1 引言 | 第124页 |
| 6.2 仪器与试剂 | 第124-126页 |
| 6.2.1 仪器 | 第124-125页 |
| 6.2.2 试剂 | 第125-126页 |
| 6.2.3 试剂配制 | 第126页 |
| 6.2.4 菌种、细胞、质粒、动物及样本 | 第126页 |
| 6.3 实验方法 | 第126-129页 |
| 6.3.1 质粒制备 | 第126页 |
| 6.3.2 细胞培养 | 第126页 |
| 6.3.3 细胞转染 | 第126页 |
| 6.3.4 细胞筛选 | 第126页 |
| 6.3.5 小鼠肺转移模型 | 第126-127页 |
| 6.3.6 蛋白样品制备 | 第127页 |
| 6.3.7 蛋白浓度测定 | 第127页 |
| 6.3.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第127页 |
| 6.3.9 免疫印迹(western blot,WB) | 第127页 |
| 6.3.10 H&E染色(Harris and Eosin staining) | 第127-128页 |
| 6.3.11 免疫组织化学(immunohistochemistry) | 第128-129页 |
| 6.3.12 统计学分析 | 第129页 |
| 6.4 实验结果与分析 | 第129-133页 |
| 6.4.1 DACH1对BALB/c小鼠体内4T1/Luc细胞肺转移能力的影响 | 第129-132页 |
| 6.4.2 DACH1与E-cadherin在人乳腺癌组织中的相关性 | 第132-133页 |
| 6.5 讨论 | 第133-134页 |
| 6.6 本章小结 | 第134-135页 |
| 7 结论与展望 | 第135-137页 |
| 7.1 结论 | 第135-136页 |
| 7.2 创新点 | 第136页 |
| 7.3 展望 | 第136-137页 |
| 参考文献 | 第137-147页 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 | 第147-149页 |
| 致谢 | 第149-150页 |
| 作者简介 | 第150页 |
