| 摘要 | 第10-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 缩略语表 | 第17-18页 |
| 前言 | 第18-19页 |
| 第一部分 文献综述 | 第19-37页 |
| 第一节 磺酰脲除草剂简介 | 第19-21页 |
| 第二节 磺酰脲除草剂作用机理 | 第21-23页 |
| 2.1 磺酰脲除草剂作用位点 | 第21页 |
| 2.2 乙酰乳酸合酶(AHAS)研究现状 | 第21页 |
| 2.3 磺酰脲除草剂的作用机理 | 第21-23页 |
| 2.4 大肠杆菌的AHAS | 第23页 |
| 2.5 AHAS抑制剂 | 第23页 |
| 第三节 磺酰脲除草剂对环境和农业生产的影响 | 第23-25页 |
| 3.1 磺酰脲除草剂药害发生情况 | 第23-24页 |
| 3.2 磺酰脲除草剂对其它环境生物的影响 | 第24-25页 |
| 第四节 磺酰脲除草剂的微生物降解 | 第25-29页 |
| 4.1 降解磺酰脲除草剂的微生物种类 | 第25-26页 |
| 4.2 磺酰脲除草剂的微生物代谢途径 | 第26-27页 |
| 4.3 除草剂去活性酶基因的克隆 | 第27页 |
| 4.4 微生物修复的作用机制 | 第27-29页 |
| 第五节 Red重组系统 | 第29-30页 |
| 第六节 枯草芽孢杆菌表达系统概述 | 第30-32页 |
| 6.1 枯草芽孢杆菌 | 第30-31页 |
| 6.2 枯草芽抱杆菌表达系统 | 第31-32页 |
| 参考文献 | 第32-37页 |
| 第二部分 实验部分 | 第37-113页 |
| 第一章 菌株S113对磺酰脲除草剂代谢途径的研究 | 第37-51页 |
| 1 材料与方法 | 第37-39页 |
| 1.1 菌株、培养基和试剂 | 第37页 |
| 1.2 菌株5113粗酶液的制备 | 第37页 |
| 1.3 粗酶液中磺酰脲除草剂水解酶酶活反应体系的建立 | 第37-38页 |
| 1.4 活性磺酰脲除草剂水解酶的分子量测定 | 第38-39页 |
| 2 结果与分析 | 第39-48页 |
| 2.1 菌株S113粗酶液转化磺酰脲除草剂产物的检测 | 第39-46页 |
| 2.2 粗酶液对不同底物的比活力及Km | 第46页 |
| 2.3 磺酰脲除草剂水解酶的分子量 | 第46-48页 |
| 本章讨论 | 第48页 |
| 参考文献 | 第48-51页 |
| 第二章 磺酰脲除草剂敏感型大肠杆菌的构建 | 第51-67页 |
| 第一节 大肠杆菌乙酰乳酸合酶对磺酰脲除草剂抗性的测定 | 第51-59页 |
| 1 材料与方法 | 第51-57页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第51-52页 |
| 1.2 试剂和培养基 | 第52页 |
| 1.3 DNA的提取 | 第52页 |
| 1.4 大肠杆菌感受态制备 | 第52-53页 |
| 1.5 质粒的提取 | 第53-54页 |
| 1.6 大肠杆菌ilvG基因的回复突变 | 第54页 |
| 1.7 ilvBN和ilvlH的PCR扩增 | 第54-55页 |
| 1.8 ilvGM，ilvBN,ilvlH表达载体的构建 | 第55页 |
| 1.9 大肠杆菌AHAS Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ诱导表达 | 第55页 |
| 1.10 样品的处理 | 第55页 |
| 1.11 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第55-56页 |
| 1.12 电泳 | 第56页 |
| 1.13 染色脱色 | 第56-57页 |
| 1.14 乙酰乳酸合酶酶活力的测定 | 第57页 |
| 2 结果与分析 | 第57-59页 |
| 2.1 PCR扩增大肠杆菌乙酰乳酸合酶基因 | 第57-58页 |
| 2.2 大肠杆菌AHAS Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ在E. coli BL21中的表达 | 第58-59页 |
| 2.3 大肠杆菌AHAS Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ对AHAS抑制剂抗性强度测定 | 第59页 |
| 第二节 磺酰脲除草剂敏感型大肠杆菌的构建 | 第59-64页 |
| 1 材料与方法 | 第60-61页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第60页 |
| 1.2 试剂和培养基 | 第60页 |
| 1.3 Red重组酶的诱导表达和感受态制备 | 第60页 |
| 1.4 电击转化 | 第60-61页 |
| 1.5 回复突变基因ilvG的测序验证 | 第61页 |
| 1.6 质粒消除 | 第61页 |
| 1.7 最小抑菌浓度(MIC)的测定 | 第61页 |
| 2 结果与分析 | 第61-64页 |
| 2.1 缬氨酸抗性菌株的构建 | 第61-62页 |
| 2.2 不同浓度的单链DNA对重组效率的影响 | 第62-63页 |
| 2.3 AHAS抑制剂对E.coli DH10B(ilvG+)抑制 | 第63-64页 |
| 本章讨论 | 第64页 |
| 参考文献 | 第64-67页 |
| 第三章 磺酰脲除草剂水解酶SuLE的基因克隆、表达和酶学特性研究 | 第67-101页 |
| 第一节 磺酰脲除草剂水解酶SulE的基因克隆 | 第68-83页 |
| 1 材料与方法 | 第68-76页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第68页 |
| 1.2 试剂和培养基 | 第68-69页 |
| 1.3 总DNA部分酶切体系建立 | 第69-70页 |
| 1.4 鸟枪法构建基因文库示意图 | 第70-71页 |
| 1.5 凝胶电泳回收酶切片段 | 第71页 |
| 1.6 酶连体系 | 第71-72页 |
| 1.7 转化和基因文库的构建 | 第72页 |
| 1.8 阳性克隆的粗酶液转化磺酰脲除草剂酶活力的检测 | 第72页 |
| 1.9 阳性克降序列测定及分析 | 第72-73页 |
| 1.10 信号肽序列验证 | 第73页 |
| 1.11 sulE基因的扩增 | 第73页 |
| 1.12 pBBR1-MCS5-su/E载体的构建 | 第73页 |
| 1.13 菌株S113的转化条件 | 第73-74页 |
| 1.14 SulE蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化 | 第74-76页 |
| 1.15 重组SulE的鉴定 | 第76页 |
| 2 结果与分析 | 第76-83页 |
| 2.1 菌株S113总DNA提取和Sau3Al酶切 | 第76-78页 |
| 2.2 阳性克降的获得 | 第78页 |
| 2.3 阳性克隆测序和ORF分析 | 第78-79页 |
| 2.4 sulE启动子预测 | 第79页 |
| 2.5 SulE氨基酸序列分析 | 第79-80页 |
| 2.6 信号肽预测 | 第80-81页 |
| 2.7 菌株S113表达的SulE的纯化 | 第81-82页 |
| 2.8 重组蛋白6 × His-tagged SulE的鉴定 | 第82-83页 |
| 第二节 SulE的原核表达和纯化及酶学特性研究 | 第83-91页 |
| 1 材料与方法 | 第83-87页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第83页 |
| 1.2 试剂和培养基 | 第83页 |
| 1.3 sulE基因PCR扩增 | 第83-84页 |
| 1.4 表达载体的构建 | 第84页 |
| 1.5 SulE的表达菌株构建和诱导表达 | 第84-85页 |
| 1.6 SulE蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化 | 第85页 |
| 1.7 SulE分子量测定 | 第85页 |
| 1.8 等电点pl的测定 | 第85页 |
| 1.9 酶的热稳定性与最适反应温度 | 第85页 |
| 1.10 酶的酸碱稳定性与最适反应pH值 | 第85-86页 |
| 1.11 金属离子对酶活力的影响 | 第86页 |
| 1.12 酶的动力学参数测定 | 第86-87页 |
| 2 结果与分析 | 第87-91页 |
| 2.1 PCR扩增的sulE | 第87页 |
| 2.2 磺酰脲除草剂水解酶SulE的纯化 | 第87-88页 |
| 2.3 SulE分子量测定 | 第88页 |
| 2.4 等电点pl测定 | 第88页 |
| 2.5 SulE热稳定性和最适温度 | 第88-89页 |
| 2.6 SulE酸碱稳定性和最适pH值 | 第89页 |
| 2.7 金属离子和化学试剂对酶活力影响 | 第89页 |
| 2.8 SulE对不同底物的动力学常数 | 第89-91页 |
| 第三节 SulE对菌株S113和S.CEREVISIAE BY4742磺酰脲除草剂抗性的影响 | 第91-98页 |
| 1 材料与方法 | 第91-95页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第91-92页 |
| 1.2 试剂和培养基 | 第92页 |
| 1.3 同源重组载体的构建 | 第92页 |
| 1.4 SulE酵母表达载体的构建 | 第92-94页 |
| 1.5 酿酒酵母的电转化 | 第94页 |
| 1.6 菌株磺酰脲除草剂抗性的检测 | 第94-95页 |
| 2 结果与分析 | 第95-98页 |
| 2.1 sulE基因的敲除 | 第95页 |
| 2.2 菌株S113Δsu/E对磺酰脲除草剂的抗性 | 第95-97页 |
| 2.3 S.cerevisiae BYsulE对磺酰脲除草剂抗性 | 第97-98页 |
| 本章讨论 | 第98-99页 |
| 参考文献 | 第99-101页 |
| 第四章 构建磺酰脲除草剂降解工程菌对污染土壤生物修复作用的研究 | 第101-113页 |
| 1 材料与方法 | 第101-105页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第101-102页 |
| 1.2 试剂和培养基 | 第102页 |
| 1.3 穿梭分泌表达载体pP43sulE的构建 | 第102页 |
| 1.4 枯草杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第102-103页 |
| 1.5 菌株磺酰脲除草剂抗性的检测 | 第103页 |
| 1.6 发酵液酶活力检测 | 第103页 |
| 1.7 B.subtilis sulE传代过程中质粒和表达的稳定性 | 第103-104页 |
| 1.8 供试土壤 | 第104页 |
| 1.9 土壤中残留甲磺隆的测定 | 第104页 |
| 1.10 不同接种量对士壤中甲磺隆降解的影响 | 第104页 |
| 1.11 B.subtilis sulE对土壤中甲磺隆降解的进程 | 第104-105页 |
| 2 结果与分析 | 第105-110页 |
| 2.1 B.subtilis sulE的96 h发酵液SulE酶活力 | 第105页 |
| 2.2 B.subtilis sulE传代过程中质粒和表达的稳定性 | 第105-106页 |
| 2.3 工程菌株B.subtilis sulE对甲磺隆的降解及抗性 | 第106-107页 |
| 2.4 土壤的部分理化性质 | 第107页 |
| 2.5 土壤中甲磺降的检出限 | 第107-108页 |
| 2.6 接种量对土壤中甲磺隆降解的影响 | 第108-109页 |
| 2.7 B.subtilis sulE降解土壤中甲磺隆的进程 | 第109-110页 |
| 本章讨论 | 第110页 |
| 参考文献 | 第110-113页 |
| 全文总结 | 第113-115页 |
| 博士论文创新点 | 第115-117页 |
| 附录一 实验用培养基及分子生物学试剂 | 第117-120页 |
| 附录二 文中使用引物列表 | 第120-121页 |
| 附录三 阳性克隆子的核酸序列 | 第121-124页 |
| 附录四 sulE的核酸序列 | 第124-125页 |
| 附录五 磺酰脲除草剂水解酶SulE的氨基酸序列 | 第125-127页 |
| 博士期间发表论文 | 第127-129页 |
| 致谢 | 第129页 |
