| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 中英文缩略词 | 第8-12页 |
| 1 综述 | 第12-24页 |
| ·生态系统的氮素循环 | 第12页 |
| ·氮素循环的四个过程 | 第12-14页 |
| ·氮污染的来源和危害 | 第14-15页 |
| ·生物脱氮工艺 | 第15-18页 |
| ·传统生物脱氮工艺 | 第15-16页 |
| ·新型生物脱氮工艺 | 第16-18页 |
| ·脱氮系统的功能菌株及其功能基因 | 第18-22页 |
| ·氨氧化反应过程 | 第19-20页 |
| ·氨单加氧酶基因 | 第20-21页 |
| ·羟胺氧化酶基因 | 第21页 |
| ·生物脱氮工程菌的研究进展 | 第21-22页 |
| ·本课题的目的意义、研究内容和技术路线 | 第22-24页 |
| ·本课题的目的意义 | 第22页 |
| ·研究内容 | 第22-23页 |
| ·技术路线 | 第23-24页 |
| 2 amoA基因和hao基因的克隆 | 第24-37页 |
| ·实验材料 | 第24-26页 |
| ·主要试剂与培养基 | 第24-25页 |
| ·基因工程载体、菌株及试剂盒 | 第25页 |
| ·主要仪器与设备 | 第25-26页 |
| ·实验方法 | 第26-31页 |
| ·氨氧化细菌的富集培养 | 第26页 |
| ·amoA基因和hao基因的引物设计 | 第26页 |
| ·土壤富集液宏基因组的提取 | 第26页 |
| ·PCR扩增DNA片段和电泳检测 | 第26-28页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第28-29页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第29页 |
| ·PCR纯化产物末端加A反应 | 第29页 |
| ·连接 | 第29页 |
| ·重组质粒的转化 | 第29页 |
| ·转化子的筛选及菌种保藏 | 第29-30页 |
| ·重组子的鉴定：质粒的提取、酶切及电泳检测 | 第30-31页 |
| ·扩增片段基因的测序与序列分析 | 第31页 |
| ·结果与分析 | 第31-35页 |
| ·氨氧化细菌的富集培养 | 第31页 |
| ·amoA基因和hao基因的PCR扩增 | 第31-33页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第33页 |
| ·阳性转化子的筛选及重组子的鉴定 | 第33-35页 |
| ·扩增片段的基因序列测序结果 | 第35页 |
| ·讨论 | 第35-36页 |
| ·本章小结 | 第36-37页 |
| 3 AmoA和Hao的生物信息学分析 | 第37-47页 |
| ·生物信息学工具及方法 | 第37-38页 |
| ·基因序列比对及进化树构建 | 第37页 |
| ·基因序列进化树构建 | 第37页 |
| ·蛋白质预测分析软件ExaPASy | 第37页 |
| ·蛋白质二级结构预测软件SOPM | 第37页 |
| ·蛋白质的跨膜螺旋分析TMHMM Server v.2.0 | 第37页 |
| ·蛋白质疏水性预测分析软件ExPASy的ProtScale | 第37页 |
| ·蛋白质三维结构预测分析软件SWISS-MODEL | 第37-38页 |
| ·结果与分析 | 第38-45页 |
| ·amoA和hao基因序列比对结果 | 第38-39页 |
| ·amoA和hao基因序列进化树构建结果 | 第39-40页 |
| ·AmoA和Hao的氨基酸组成分析 | 第40-41页 |
| ·AmoA和Hao二级结构的预测 | 第41-42页 |
| ·AmoA和Hao的跨膜螺旋分析 | 第42-43页 |
| ·AmoA和Hao的疏水性分析 | 第43-45页 |
| ·AmoA和Hao的三维结构预测 | 第45页 |
| ·讨论 | 第45-46页 |
| ·本章小结 | 第46-47页 |
| 4 原核表达工程菌的构建及功能检测 | 第47-62页 |
| ·实验材料 | 第47页 |
| ·主要试剂与培养基 | 第47页 |
| ·基因工程载体、菌株及试剂盒 | 第47页 |
| ·主要仪器与设备 | 第47页 |
| ·实验方法 | 第47-52页 |
| ·重组菌BL21(DE3)-pQE30-amoA和BL21(DE3)-pET28a-hao的构建 | 第47-48页 |
| ·反转录PCR验证基因表达 | 第48-50页 |
| ·AmoA和Hao酶活测定 | 第50-51页 |
| ·重组菌BL21(DE3)-pQE30-amoA-pET28a-hao的构建 | 第51页 |
| ·重组菌氧化铵能力测定 | 第51-52页 |
| ·结果与分析 | 第52-60页 |
| ·重组菌BL21(DE3)-pQE30-amoA和BL21(DE3)-pET28a-hao的构建 | 第52-54页 |
| ·反转录PCR验证蛋白表达 | 第54-56页 |
| ·AmoA和Hao酶活测定结果 | 第56-58页 |
| ·重组菌BL21(DE3)-pQE30-amoA-pET28a-hao的构建 | 第58-59页 |
| ·重组菌功能测定结果 | 第59-60页 |
| ·讨论 | 第60-61页 |
| ·本章小结 | 第61-62页 |
| 5 结论与展望 | 第62-64页 |
| ·结论 | 第62页 |
| ·展望 | 第62-64页 |
| 致谢 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-73页 |
| 附录A 部分化学试剂配方和培养基配置 | 第73-74页 |
| 附录B 克隆重组子的amoA和hao基因序列 | 第74-77页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第77-78页 |
