| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-21页 |
| ·磷脂酶D及其催化机理 | 第10-13页 |
| ·磷脂酶D | 第10页 |
| ·磷脂酶D的初级和多级结构 | 第10-12页 |
| ·磷脂酶D的反应催化机理 | 第12-13页 |
| ·磷脂酶D的酶活检测方法 | 第13-14页 |
| ·底物识别和特异性 | 第14-16页 |
| ·PHLDAxExxxR氨基酸序列 | 第14-15页 |
| ·关键氨基酸位点W187,Y191,Y385 | 第15页 |
| ·GS/GG模块 | 第15-16页 |
| ·PLD异源表达研究现状 | 第16-17页 |
| ·PLD在大肠杆菌系统中的表达 | 第16页 |
| ·PLD在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第16页 |
| ·PLD在链霉菌中的表达 | 第16-17页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第17页 |
| ·解脂耶氏表达系统 | 第17-19页 |
| ·研究目的及内容 | 第19-21页 |
| 第二章 磷脂酶D在毕赤酵母中的异源表达 | 第21-38页 |
| ·引言 | 第21页 |
| ·材料和仪器 | 第21-24页 |
| ·仪器与实验设备 | 第21-22页 |
| ·相关酶和生物试剂盒 | 第22-23页 |
| ·培养基 | 第23页 |
| ·缓冲液与试剂的配置 | 第23页 |
| ·菌种和质粒 | 第23页 |
| ·磷脂酶D基因 | 第23-24页 |
| ·引物设计 | 第24页 |
| ·抗生素配制 | 第24页 |
| ·实验方法 | 第24-31页 |
| ·磷脂酶D基因密码子的优化 | 第24-27页 |
| ·糖基化位点的预测 | 第27-28页 |
| ·糖基化位点定点突变 | 第28-30页 |
| ·PLD信号肽的去除 | 第30页 |
| ·毕赤酵母的转化 | 第30页 |
| ·PLD在Pichia pastoris中表达的基因验证 | 第30-31页 |
| ·PLD在毕赤酵母中的蛋白表达验证 | 第31页 |
| ·PLD的酶活测定 | 第31页 |
| ·实验结果 | 第31-37页 |
| ·pIC9K-PLD重组质粒的构建 | 第31-33页 |
| ·PLD在毕赤酵母中的生长 | 第33-35页 |
| ·PLD在Pichia pastoris中的表达验证 | 第35页 |
| ·PLD在Pichia pastoris中的表达 | 第35-36页 |
| ·PLD在毕赤酵母中的表达活性 | 第36-37页 |
| ·小结 | 第37-38页 |
| 第三章 PLD在解脂耶氏酵母中的表达 | 第38-49页 |
| ·引言 | 第38页 |
| ·材料和仪器 | 第38-39页 |
| ·设备仪器 | 第38页 |
| ·相关酶和生物试剂盒 | 第38页 |
| ·培养基 | 第38页 |
| ·缓冲液与试剂的配制 | 第38-39页 |
| ·菌种和质粒 | 第39页 |
| ·相关引物设计 | 第39页 |
| ·实验方法 | 第39-42页 |
| ·表达质粒的构建 | 第39-40页 |
| ·解脂耶氏酵母的转化 | 第40-41页 |
| ·PLD在解脂耶氏酵母中的表达验证 | 第41页 |
| ·PLD在解脂耶氏酵母中的表达 | 第41-42页 |
| ·实验结果 | 第42-48页 |
| ·去除自身信号肽/携带自身信号肽pINA系列表达质粒的构建 | 第42-43页 |
| ·pINA-N205286Q表达质粒的构建 | 第43页 |
| ·PLD在解脂耶氏酵母中的表达 | 第43-48页 |
| ·小结 | 第48-49页 |
| 第四章 PLD在大肠杆菌中的表达 | 第49-59页 |
| ·引言 | 第49页 |
| ·材料和仪器 | 第49-50页 |
| ·实验仪器 | 第49页 |
| ·培养基 | 第49-50页 |
| ·菌种和质粒 | 第50页 |
| ·实验方法 | 第50-51页 |
| ·引物设计 | 第50页 |
| ·大肠杆菌表达质粒的重组构建 | 第50页 |
| ·Rosseta感受态的制备 | 第50-51页 |
| ·大肠杆菌转化 | 第51页 |
| ·PLD在大肠杆菌中的诱导表达 | 第51页 |
| ·大肠杆菌生长曲线的绘制 | 第51页 |
| ·实验结果 | 第51-58页 |
| ·大肠杆菌重组表达质粒的构建 | 第51-52页 |
| ·阳性克隆子的筛选和验证 | 第52-53页 |
| ·pET-22PLD在大肠杆菌中的表达 | 第53-54页 |
| ·pET-28PLD在大肠杆菌中的表达 | 第54-55页 |
| ·PLD在大肠杆菌中诱导表达的温度确定 | 第55页 |
| ·大肠杆菌生长曲线的绘制 | 第55-56页 |
| ·PLD在大肠杆菌中的高密度发酵 | 第56-58页 |
| ·小结 | 第58-59页 |
| 第五章 PLD在链霉菌中的表达 | 第59-74页 |
| ·引言 | 第59-60页 |
| ·红霉素抗性启动子 | 第59页 |
| ·P Sau3A组成型启动子 | 第59-60页 |
| ·实验材料和仪器 | 第60-61页 |
| ·实验仪器 | 第60页 |
| ·培养基 | 第60-61页 |
| ·试剂的配制 | 第61页 |
| ·菌株和质粒 | 第61页 |
| ·实验方法 | 第61-66页 |
| ·P Sau3A启动子的合成 | 第61页 |
| ·PermE~*启动子的获得 | 第61-62页 |
| ·pNW-S1质粒的改造 | 第62-63页 |
| ·pNW-S3和pNW-S4质粒的构建 | 第63-64页 |
| ·PLD重组表达质粒的构建 | 第64-65页 |
| ·链霉菌重组质粒的转化 | 第65-66页 |
| ·实验结果 | 第66-72页 |
| ·pNW-S2质粒的构建 | 第66页 |
| ·Sau3A启动子的获得 | 第66-67页 |
| ·ermE~*启动子的获得 | 第67页 |
| ·pNW-S3和pNW-S4质粒的构建 | 第67页 |
| ·PLD目的基因的连接 | 第67-68页 |
| ·TK24的转化 | 第68页 |
| ·阳性克隆的验证 | 第68-69页 |
| ·转化子的发酵和PLD的酶活测定 | 第69页 |
| ·转化子的发酵优化 | 第69-70页 |
| ·各项生长参数的测定 | 第70-72页 |
| ·结论 | 第72-74页 |
| 第六章 总结 | 第74-76页 |
| ·结论 | 第74-75页 |
| ·展望 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
