| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-12页 |
| 第一章 前言 | 第12-27页 |
| ·纤维素 | 第12-13页 |
| ·纤维素酶 | 第13-23页 |
| ·纤维素酶的组成 | 第13-15页 |
| ·纤维素酶的来源 | 第15-17页 |
| ·产纤维素酶的真菌类 | 第15页 |
| ·产纤维素酶的细菌类 | 第15-16页 |
| ·产纤维素酶的放线菌类 | 第16页 |
| ·产纤维素酶的昆虫类 | 第16-17页 |
| ·产纤维素酶的植物类 | 第17页 |
| ·纤维素酶的结构和功能 | 第17-18页 |
| ·纤维素酶的降解机理 | 第18-20页 |
| ·纤维素酶的应用 | 第20-23页 |
| ·食品加工及活性物质的提取 | 第20-21页 |
| ·酿造工业 | 第21页 |
| ·生产生物乙醇 | 第21-22页 |
| ·饲料加工业 | 第22页 |
| ·生产微生物蛋白 | 第22页 |
| ·造纸业的应用 | 第22-23页 |
| ·农业杂交育种的应用 | 第23页 |
| ·纤维素酶的研究进展 | 第23页 |
| ·纤维素酶的基因克隆及表达 | 第23-24页 |
| ·研究目的和意义 | 第24-26页 |
| ·技术路线 | 第26-27页 |
| 第二章 材料和方法 | 第27-42页 |
| ·实验样品与耗材 | 第27页 |
| ·菌株和质粒 | 第27页 |
| ·培养基的配制 | 第27页 |
| ·工具酶和化学试剂 | 第27页 |
| ·主要实验仪器及设备 | 第27页 |
| ·方法与步骤 | 第27-42页 |
| ·基因组的提取 | 第27页 |
| ·目的基因的引物设计 | 第27-28页 |
| ·PCR扩增目的基因 | 第28-29页 |
| ·载体质粒pQE30酶切 | 第29-30页 |
| ·分别构建表达载体 | 第30页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第30页 |
| ·表达载体转入大肠杆菌感受态细胞 | 第30-31页 |
| ·阳性克隆的筛选和酶切验证 | 第31页 |
| ·重组子质粒的PCR验证及测序分析 | 第31-32页 |
| ·CMC-Na平板上的活性检测 | 第32-33页 |
| ·外源基因在大肠杆菌中的表达检测 | 第33页 |
| ·NTA-Ni亲和层析纯化蛋白 | 第33页 |
| ·原理 | 第33页 |
| ·再生和活化镍离子亲和层析柱 | 第33页 |
| ·内切葡聚糖酶ce18A和外切葡聚糖酶ce148B的纯化 | 第33页 |
| ·纯化产物的SDS-PAGE检测 | 第33页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第33-35页 |
| ·内切葡聚糖酶酶学活性测定 | 第35-37页 |
| ·葡萄糖标准曲线 | 第35-36页 |
| ·最适pH | 第36页 |
| ·最适温度 | 第36页 |
| ·比活力和K_m值的测定 | 第36-37页 |
| ·外切葡聚糖酶酶活性研究 | 第37页 |
| ·外切葡聚糖酶cel48B定点突变 | 第37-40页 |
| ·突变方法 | 第37-38页 |
| ·确定定点突变位点 | 第38页 |
| ·设计突变点引物 | 第38-39页 |
| ·PCR扩增带突变基因 | 第39页 |
| ·DpnI消化PCR模板 | 第39页 |
| ·PCR产物转入感受态细胞E. coli XL10-gold | 第39页 |
| ·测序筛选突变子 | 第39页 |
| ·将突变质粒转入感受态细胞E.coli XL1-blue | 第39-40页 |
| ·纯化突变酶并用SDS-PAGE分析 | 第40页 |
| ·突变酶活鉴定 | 第40页 |
| ·内切葡聚糖酶与外切葡聚糖酶的协同作用研究 | 第40-42页 |
| 第三章 结果与分析 | 第42-59页 |
| ·内切葡聚糖酶cel8A | 第42-49页 |
| ·信号肽、跨膜区及功能域预测 | 第42-43页 |
| ·cel8A基因的PCR扩增 | 第43-44页 |
| ·表达载体的琼脂糖凝胶电泳验证 | 第44页 |
| ·测序及同源比对 | 第44-45页 |
| ·外源基因表达和纯化蛋白的SDS-PAGE检测 | 第45页 |
| ·内切葡聚糖酶CMC平板上的活性检测 | 第45-46页 |
| ·酶学活性测定 | 第46-49页 |
| ·最适pH | 第46-47页 |
| ·最适温度 | 第47页 |
| ·酶活力和K_m值的测定方法 | 第47-49页 |
| ·外切葡聚糖酶cel48B | 第49-58页 |
| ·信号肽及跨膜区预测 | 第49-50页 |
| ·cel48B基因的PCR扩增 | 第50页 |
| ·表达载体构建的琼脂糖凝胶电泳验证 | 第50-51页 |
| ·测序及同源比对 | 第51页 |
| ·外源基因表达和纯化蛋白的SDS-PAGE检测 | 第51页 |
| ·外切葡聚糖酶cel48B活性检测 | 第51-53页 |
| ·cel48B基因定点突变 | 第53-58页 |
| ·确定突变位点 | 第53-55页 |
| ·PCR扩增突变基因 | 第55-56页 |
| ·测序筛选突变子 | 第56-57页 |
| ·突变蛋白纯化并用SDS-PAGE分析 | 第57页 |
| ·突变酶活性研究 | 第57-58页 |
| ·内切葡聚糖酶与外切葡聚糖酶的协同作用研究 | 第58-59页 |
| 第四章 讨论 | 第59-63页 |
| ·内切葡聚糖酶的酶活特性 | 第59-60页 |
| ·pH的影响 | 第59页 |
| ·温度的影响 | 第59-60页 |
| ·比活力和K_m值 | 第60页 |
| ·外切葡聚糖酶的酶活性质 | 第60-61页 |
| ·纤维素酶的协同机制 | 第61-63页 |
| 第五章 结论与展望 | 第63-65页 |
| ·结论 | 第63-64页 |
| ·问题与展望 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-71页 |
| 附录1 | 第71-75页 |
| 附录2 | 第75-79页 |
| 附录3 | 第79-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第83页 |
