| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 缩略词 | 第8-11页 |
| 第一部分 文献综述 | 第11-29页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第11-22页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的研究概况 | 第11-12页 |
| ·斯德毕赤酵母表达系统的发展历史 | 第12页 |
| ·大肠杆菌和毕赤酵母表达系统的比较 | 第12页 |
| ·巴斯德毕赤酵母的宿主菌 | 第12-13页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达载体 | 第13-16页 |
| ·整合方式与转化方法 | 第16-17页 |
| ·控制蛋白质表达的策略 | 第17-19页 |
| ·后翻译修饰 | 第19-21页 |
| ·异源蛋白的表达 | 第21-22页 |
| ·其他的真核表达系统 | 第22页 |
| ·克隆方式 | 第22-24页 |
| ·依赖连接酶的克隆方式 | 第22-23页 |
| ·不依赖连接酶的克隆方式 | 第23-24页 |
| ·高拷贝整合的筛选 | 第24-26页 |
| ·人工体外构建高拷贝重组质粒 | 第24-25页 |
| ·选用含有抗性筛选标记的表达载体 | 第25-26页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第26-29页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第29-42页 |
| ·材料 | 第29-35页 |
| ·菌株和质粒 | 第29-31页 |
| ·培养基 | 第31页 |
| ·试剂和酶 | 第31-32页 |
| ·仪器和设备 | 第32页 |
| ·主要缓冲液 | 第32-33页 |
| ·引物 | 第33-35页 |
| ·方法 | 第35-42页 |
| ·PCR目的基因 | 第35-36页 |
| ·琼脂糖凝胶回收PCR产物 | 第36-37页 |
| ·PCR产物的T4 DNA聚合酶处理 | 第37页 |
| ·大肠杆菌化学法感受态细胞的制备及转化方式 | 第37-38页 |
| ·质粒DNA的抽提 | 第38-39页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达蛋白 | 第39-40页 |
| ·毕赤酵母感受态的制备 | 第40页 |
| ·毕赤酵母的电击转化 | 第40页 |
| ·外源基因在毕赤酵母中的摇瓶诱导表达 | 第40-41页 |
| ·Bradford法测定蛋白总浓度 | 第41-42页 |
| 第三部分 结果与分析 | 第42-66页 |
| ·基于pPIC9k的一系列表达载体的构建和验证 | 第42-57页 |
| ·基于pPIC9k的四种表达载体的构建 | 第42-47页 |
| ·四种载体的酶切验证 | 第47-48页 |
| ·四种载体的功能验证 | 第48-57页 |
| ·基于Biobrick方法,载体pHBM905BDM的构建和验证 | 第57-66页 |
| ·基于Biobrick方法,载体pHBM905M的改造 | 第57-58页 |
| ·载体pHBM905BDM的酶切验证 | 第58-59页 |
| ·载体pHBM905BDM的克隆验证 | 第59-63页 |
| ·pHBM905BDM载体的表达验证 | 第63-66页 |
| 第四部分 展望与讨论 | 第66-69页 |
| 参考文献 | 第69-75页 |
| 致谢 | 第75页 |