| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-26页 |
| ·胸苷酸合成酶简介 | 第12-14页 |
| ·胸苷酸合成酶抑制剂的研究现状 | 第14-19页 |
| ·非叶酸结构类似物TS 抑制剂 | 第14-15页 |
| ·叶酸结构类似物TS 抑制剂 | 第15-18页 |
| ·具有独特结构的TS 抑制剂 | 第18-19页 |
| ·重组蛋白质的纯化方法简介 | 第19-21页 |
| ·硫酸铵沉淀法 | 第19页 |
| ·离子交换法 | 第19-20页 |
| ·排阻层析法 | 第20页 |
| ·亲和层析法分离纯化蛋白质 | 第20-21页 |
| ·亲和层析简介 | 第20-21页 |
| ·Ni-NTA 亲和层析原理 | 第21页 |
| ·蛋白质结晶培养方法简介 | 第21-24页 |
| ·蛋白质结晶的基本过程 | 第21-22页 |
| ·影响蛋白质结晶的因素 | 第22页 |
| ·蛋白质结晶的研究进展 | 第22-24页 |
| ·悬滴结晶法培养蛋白质晶体简介 | 第24页 |
| ·本课题研究意义及计划方案 | 第24-26页 |
| ·课题研究意义 | 第24-25页 |
| ·课题研究的计划方案 | 第25-26页 |
| 第二章 野生型人类胸苷酸合成酶表达载体在大肠杆菌中的高效表达 | 第26-47页 |
| 前言 | 第26-27页 |
| ·实验材料 | 第27-32页 |
| ·实验菌种及质粒 | 第27页 |
| ·主要试剂、酶及其生产厂家 | 第27-28页 |
| ·实验仪器 | 第28-29页 |
| ·常用试剂、缓冲液、培养基的配制方法 | 第29-32页 |
| ·实验方法 | 第32-38页 |
| ·大肠杆菌菌株活化 | 第32页 |
| ·碱法提取大肠杆菌质粒 | 第32-33页 |
| ·使用高保真Pfu DNA Polymerase 进行PCR 扩增目的基因 | 第33页 |
| ·DNA 样品的琼脂糖凝胶电泳检测 | 第33-34页 |
| ·利用胶回收试剂盒回收电泳凝胶中的目的DNA | 第34页 |
| ·胶回收产物加A | 第34页 |
| ·T/A 克隆 | 第34-35页 |
| ·限制性内切酶反应 | 第35页 |
| ·连接反应 | 第35-36页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备与转化感受态 | 第36页 |
| ·阳性转化子的筛选 | 第36-37页 |
| ·大肠杆菌的诱导表达 | 第37页 |
| ·SDS-PAGE 检测蛋白质分子大小 | 第37-38页 |
| ·实验结果分析 | 第38-45页 |
| ·高保真酶进行PCR 目的基因扩增 | 第38-39页 |
| ·T/A 克隆及阳性亚克隆子的筛选和鉴定 | 第39-41页 |
| ·重组质粒TS-pMD18-T 和表达质粒pET-286(+)的双酶切 | 第41-43页 |
| ·目的基因TS 与表达载体pET-286(+)的连接及阳性克隆的鉴定筛选 | 第43-44页 |
| ·野生型hTS 的诱导表达 | 第44-45页 |
| ·实验小结 | 第45-47页 |
| 第三章 野生型重组人 TS 蛋白的提取纯化与体外复性 | 第47-56页 |
| 前言 | 第47-48页 |
| ·实验材料 | 第48-50页 |
| ·实验仪器 | 第48页 |
| ·常用试剂配制 | 第48-50页 |
| ·亲和色谱层析所用试剂 | 第48-49页 |
| ·透析所用试剂 | 第49页 |
| ·Bradford 染色用试剂 | 第49-50页 |
| ·实验方法 | 第50-52页 |
| ·亲和色谱层析分离蛋白质 | 第50-51页 |
| ·透析袋的预处理 | 第51页 |
| ·待复性蛋白的预处理 | 第51页 |
| ·变性蛋白的透析复性 | 第51-52页 |
| ·蛋白复性得率的测定（Bradford 法测蛋白质浓度） | 第52页 |
| ·待结晶野生型人TS 蛋白质的预处理 | 第52页 |
| ·实验结果与分析 | 第52-55页 |
| ·亲和色谱分离目的蛋白 | 第52-53页 |
| ·复性前后蛋白质的SDS-PAGE 电泳分析 | 第53-54页 |
| ·野生型重组hTS 复性得率的测定 | 第54-55页 |
| ·蛋白质纯化复性后的保存 | 第55页 |
| ·实验小结 | 第55-56页 |
| 第四章 野生型重组人 TS 酶生物活性与抑制剂抑制活性分析以及蛋白质晶体的培养 | 第56-66页 |
| 前言 | 第56-57页 |
| ·实验设备与材料 | 第57-58页 |
| ·实验设备与材料 | 第57-58页 |
| ·实验试剂配制 | 第58页 |
| ·实验方法与步骤 | 第58-61页 |
| ·野生型重组hTS 酶活力U 及比活SP 的测定 | 第58页 |
| ·抑制剂与酶相互作用研究 | 第58-59页 |
| ·抑制剂与酶的有效孵化时间t | 第58-59页 |
| ·通用人类TS 抑制剂IC50 的测定 | 第59页 |
| ·悬滴结晶法培养蛋白质晶体 | 第59-61页 |
| ·实验结果与分析 | 第61-65页 |
| ·抑制剂与酶的有效孵化时间t 的确定 | 第61页 |
| ·野生型重组hTS 酶活力U 及比活力SP 的测定与结果计算 | 第61-63页 |
| ·商品化hTS 抑制剂：培美曲塞（LY231514）和雷替曲塞（Tomudex）IC50的测定 | 第63-64页 |
| ·培养重组TS 蛋白质结晶的条件分析讨论 | 第64-65页 |
| ·实验小结 | 第65-66页 |
| 研究结论与展望 | 第66-68页 |
| 参考文献 | 第68-73页 |
| 附录 | 第73-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及申请专利目录 | 第78-79页 |
