| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-10页 |
| 缩略词 | 第10-11页 |
| 1 绪论 | 第11-25页 |
| ·研究背景 | 第11-13页 |
| ·文献综述 | 第13-23页 |
| ·农药残留检测方法研究进展 | 第13-15页 |
| ·乙酰胆碱酯酶的研究进展 | 第15-20页 |
| ·乙酰胆碱酯酶基因的异源表达系统研究进展 | 第20-23页 |
| ·立论依据 | 第23页 |
| ·研究目的 | 第23页 |
| ·研究内容及技术路线 | 第23-25页 |
| ·研究内容 | 第23-24页 |
| ·技术路线 | 第24-25页 |
| 2 材料和方法 | 第25-38页 |
| ·材料 | 第25-28页 |
| ·质粒、菌株 | 第25-26页 |
| ·实验试剂 | 第26页 |
| ·主要溶液配制 | 第26-27页 |
| ·试验设备 | 第27-28页 |
| ·DmAChE 全长基因在毕赤酵母中的表达 | 第28-35页 |
| ·引物设计 | 第28页 |
| ·Dm AChE1 基因的PCR 扩增 | 第28-30页 |
| ·pPIC9K-DmAChE1 重组表达质粒的构建 | 第30-32页 |
| ·P.pastoris/pPIC9K-Dm AChE1 工程菌株的构建与筛选 | 第32-34页 |
| ·重组KM71 的表达 | 第34-35页 |
| ·去除了 GPI 的 DmAChE 基因在毕赤酵母中的表达 | 第35-38页 |
| ·引物设计 | 第35页 |
| ·Dm AChE1 基因的PCR 扩增 | 第35-36页 |
| ·pPIC9K-DmAChE2 重组表达质粒的构建 | 第36页 |
| ·P.pastoris/pPIC9K-Dm AChE1 工程菌株的构建与筛选 | 第36页 |
| ·重组KM71 的表达 | 第36页 |
| ·高表达菌株的筛选 | 第36页 |
| ·表达条件的优化 | 第36页 |
| ·重组DmAChE2 的纯化 | 第36-38页 |
| 3 结果与分析 | 第38-46页 |
| ·DmAChE 全长基因在毕赤酵母中的表达 | 第38-40页 |
| ·Dm AChE1 基因的扩增和毕赤酵母表达载体的构建 | 第38-39页 |
| ·P.pastoris/ pPIC9K-DmAChE1 工程菌株的筛选与鉴定 | 第39-40页 |
| ·重组毕赤酵母的诱导表达及酶活测定 | 第40页 |
| ·去除了 GPI 的 DmAChE 基因在毕赤酵母中的表达 | 第40-46页 |
| ·Dm AChE2 基因的扩增和毕赤酵母表达载体的构建 | 第40-41页 |
| ·P.pastoris/ pPIC9K-DmAChE2 工程菌株的筛选与鉴定 | 第41-42页 |
| ·重组毕赤酵母的诱导表达及酶活测定 | 第42页 |
| ·高表达菌株的筛选 | 第42页 |
| ·表达条件的优化 | 第42-44页 |
| ·重组DmAChE2 的纯化 | 第44-46页 |
| 4 讨论 | 第46-53页 |
| ·P.pastoris 表达系统 | 第46-47页 |
| ·影响 DmAChE 在毕赤酵母中表达的因素 | 第47-50页 |
| ·基因剂量对表达量的影响 | 第47页 |
| ·酵母自身分泌的蛋白酶对表达量的影响 | 第47页 |
| ·GPI 对表达的影响 | 第47-48页 |
| ·密码子偏好性对表达量的影响 | 第48-49页 |
| ·RNA 的二级结构对表达量的影响 | 第49-50页 |
| ·提高外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达量的途径 | 第50-52页 |
| ·优化基因内部结构 | 第50页 |
| ·分泌信号的改造 | 第50-51页 |
| ·选择高表达的启动子 | 第51页 |
| ·优化培养条件 | 第51-52页 |
| ·DmAChE 的纯化过程中存在的问题 | 第52-53页 |
| 5 结论与后续工作建议 | 第53-54页 |
| 致谢 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-62页 |
| 附录 | 第62-64页 |
