| 摘要 | 第1-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 缩略词表(Abbreviation) | 第16-19页 |
| 第1章 文献综述 | 第19-52页 |
| 1 禽流感的流行与危害 | 第19-25页 |
| ·高致病性禽流感 | 第19-21页 |
| ·低致病性禽流感 | 第21-23页 |
| ·当前我国禽流感流行的新动态 | 第23-25页 |
| ·低致病性禽流感(H9N2亚型)仍是当前流行的主要亚型 | 第24页 |
| ·温和性禽流感和隐性感染更为常见 | 第24页 |
| ·高致病力禽流感对水禽的毒力增强 | 第24-25页 |
| ·AIV对哺乳动物的致病力在增强 | 第25页 |
| 2 禽流感病毒的特征及其致病的分子机制 | 第25-35页 |
| ·禽流感病毒的特征 | 第25-26页 |
| ·禽流感病毒的基因组及其编码蛋白 | 第26-27页 |
| ·禽流感病毒致病性相关基因及其分子机制 | 第27-33页 |
| ·血凝素(Hemagglutinin,HA) | 第27-29页 |
| ·神经氨酸酶(Neuraminidase,NA) | 第29-30页 |
| ·非结构蛋白(Non-structural Protein,NS) | 第30-31页 |
| ·基质蛋白(Matrix Proteins,M) | 第31-32页 |
| ·核蛋白(Nucleoprotein,NP)及聚合酶(Polymerase) | 第32-33页 |
| ·禽流感病毒宿主特异的分子基础 | 第33-35页 |
| ·宿主受体 | 第33页 |
| ·HA蛋白 | 第33-34页 |
| ·宿主受体对HA受体特异性的选择 | 第34页 |
| ·其他分子机制 | 第34-35页 |
| 3 NS1蛋白的研究进展 | 第35-40页 |
| ·NS1蛋白的分群及进化分析 | 第35-36页 |
| ·NS1蛋白的结构 | 第36页 |
| ·NS1蛋白与A型流感病毒的致病性 | 第36-39页 |
| ·抑制宿主蛋白的合成 | 第36-37页 |
| ·下调细胞凋亡 | 第37页 |
| ·拮抗干扰素的产生 | 第37-38页 |
| ·NS1蛋白与宿主蛋白相互作用 | 第38-39页 |
| ·NS1蛋白的应用 | 第39-40页 |
| ·NS1蛋白在禽流感鉴别诊断上的应用 | 第39-40页 |
| ·可作为携带外源基因的载体 | 第40页 |
| ·抗肿瘤 | 第40页 |
| 4 机体的抗病毒机制 | 第40-46页 |
| ·抗病毒的信号传导途径 | 第40-43页 |
| ·TLR信号传导途径 | 第41-42页 |
| ·RIG-I信号转导途径 | 第42-43页 |
| ·抗病毒相关蛋白 | 第43-46页 |
| ·干扰素 | 第43-44页 |
| ·IFN诱导的抗病毒蛋白 | 第44-45页 |
| ·MAVS | 第45页 |
| ·APOBEC3G | 第45-46页 |
| 5 蛋白质相互作用的研究进展 | 第46-52页 |
| ·酵母双杂交系统(Y2H) | 第46-47页 |
| ·串联亲和纯化(TAP) | 第47-48页 |
| ·蛋白质芯片技术(Protein chip) | 第48页 |
| ·免疫共沉淀(Co-IP) | 第48-49页 |
| ·荧光共振能量转移(FRET) | 第49页 |
| ·表面等离子共振(SPR) | 第49-50页 |
| ·基于生物信息学的蛋白质互作的研究方法 | 第50-52页 |
| 第2章 NS1基因的遗传进化分析 | 第52-64页 |
| 1 研究目的和意义 | 第52页 |
| 2 材料与方法 | 第52-56页 |
| ·主要试剂与仪器 | 第52页 |
| ·毒株、菌株和质粒 | 第52-53页 |
| ·引物设计与合成 | 第53-54页 |
| ·病毒的增殖与浓缩 | 第54页 |
| ·RNA提取 | 第54页 |
| ·RT-PCR扩增NS1基因 | 第54-55页 |
| ·PCR产物的纯化及克隆 | 第55-56页 |
| ·NS1基因序列测定及进化分析 | 第56页 |
| 3 结果与分析 | 第56-60页 |
| ·RT-PCR扩增 | 第56页 |
| ·重组质粒鉴定 | 第56-57页 |
| ·NS1基因核苷酸及其推导氨基酸同源性分析 | 第57页 |
| ·分离株NS1蛋白变异分析 | 第57-59页 |
| ·分离株的NS1基因进化分析 | 第59-60页 |
| 4 讨论 | 第60-62页 |
| ·NS1基因核苷酸和氨基酸的同源性分析 | 第60-61页 |
| ·NS1蛋白的突变位点分析 | 第61-62页 |
| ·NS1蛋白C-端氨基酸缺失的生物学意义 | 第62页 |
| 5 小结 | 第62-64页 |
| 第3章 SPF鸡感染高致病性禽流感病毒细胞凋亡的研究 | 第64-77页 |
| 1 研究的目的和意义 | 第64页 |
| 2 材料与方法 | 第64-67页 |
| ·主要试剂与仪器 | 第64-65页 |
| ·病毒 | 第65页 |
| ·试验动物 | 第65页 |
| ·SPF鸡的饲养与病毒感染 | 第65-66页 |
| ·组织样品的采集与固定 | 第66页 |
| ·石蜡组织切片的制备 | 第66页 |
| ·载玻片和盖玻片的处理 | 第66页 |
| ·组织包埋 | 第66页 |
| ·组织切片的制备 | 第66页 |
| ·TUNEL法检测细胞凋亡 | 第66-67页 |
| ·结果判定 | 第67页 |
| ·凋亡指数和统计学分析 | 第67页 |
| 3 结果与分析 | 第67-74页 |
| ·SPF鸡感染HPAIV后的临床症状及剖检变化 | 第67-68页 |
| ·HPAIV诱导的细胞凋亡 | 第68-74页 |
| ·AIV诱导鸡免疫器官的细胞凋亡 | 第68-69页 |
| ·AIV诱导鸡呼吸器官的细胞凋亡 | 第69页 |
| ·AIV诱导鸡消化器官的细胞凋亡 | 第69-73页 |
| ·AIV诱导肾脏和心脏的细胞凋亡 | 第73-74页 |
| 4 讨论 | 第74-76页 |
| ·细胞凋亡的研究意义 | 第74页 |
| ·细胞凋亡的检测方法 | 第74-75页 |
| ·AIV感染与细胞凋亡相关性分析 | 第75-76页 |
| 5 小结 | 第76-77页 |
| 第4章 禽流感病毒NS1蛋白在感染鸡组织中分布研究 | 第77-89页 |
| 1 研究目的和意义 | 第77-78页 |
| 2 材料与方法 | 第78-79页 |
| ·主要试剂与仪器 | 第78页 |
| ·病毒及试验动物 | 第78页 |
| ·SPF鸡的饲养与病毒感染 | 第78页 |
| ·组织样品的采集与固定 | 第78页 |
| ·石蜡组织切片的制备 | 第78页 |
| ·NS1蛋白的免疫组化检测 | 第78-79页 |
| ·结果判定 | 第79页 |
| 3 结果与分析 | 第79-86页 |
| ·SABC法最佳反应条件的确定 | 第79页 |
| ·NS1蛋白在各脏器中的分布 | 第79-86页 |
| ·NS1蛋白在免疫器官中的分布 | 第79-81页 |
| ·NS1蛋白在呼吸器官中的分布 | 第81页 |
| ·NS1蛋白在消化器官中的分布 | 第81-84页 |
| ·NS1蛋白在肾脏中的分布 | 第84页 |
| ·NS1蛋白在心脏和脑中的分布 | 第84-86页 |
| 4 讨论 | 第86-88页 |
| ·NS1蛋白与AIV感染 | 第86页 |
| ·NS1蛋白在免疫器官的分布 | 第86页 |
| ·NS1蛋白在非免疫器官的分布 | 第86-87页 |
| ·NS1蛋白的分布与细胞凋亡相关性分析 | 第87-88页 |
| 5 小结 | 第88-89页 |
| 第5章 利用酵母双杂交系统筛选NS1蛋白互作的宿主蛋白 | 第89-116页 |
| 1 研究目的与意义 | 第89页 |
| 2 材料与方法 | 第89-101页 |
| ·主要仪器 | 第89-90页 |
| ·试剂与质粒 | 第90-91页 |
| ·NS1基因克隆及cDNA文库构建相关试剂 | 第90页 |
| ·酵母双杂交系统相关菌株、质粒、试剂及配制方法 | 第90-91页 |
| ·NS1基因的克隆与表达 | 第91-92页 |
| ·NS1基因的扩增 | 第91-92页 |
| ·PCR产物的TA克隆及序列分析 | 第92页 |
| ·NS1基因的表达与活性分析 | 第92页 |
| ·重组诱饵质粒pGBKT7/NS1的构建 | 第92-93页 |
| ·重组诱饵质粒pGBKT7/NS1的构建的基本策略 | 第92-93页 |
| ·诱饵质粒和插入片段的连接和转化 | 第93页 |
| ·重组诱饵质粒pGBKT7/NS1的鉴定 | 第93页 |
| ·酵母双杂交重组诱饵质粒的转化及自激活检测 | 第93-95页 |
| ·酵母菌株AH109营养表型的验证 | 第93页 |
| ·酵母菌株AH109感受态细胞的小量制备 | 第93-94页 |
| ·诱饵质粒pGBKT7/NS1转化AH109感受态细胞 | 第94页 |
| ·pGBKT7/NS1转化AH109后的自激活检测 | 第94页 |
| ·转化的pGBKT7/NS1对AH109毒性的检测 | 第94-95页 |
| ·AIV感染鸡脾脏cDNA片段的制备 | 第95-98页 |
| ·组织总RNA的提取 | 第95页 |
| ·mRNA的分离 | 第95-96页 |
| ·双链cDNA的合成 | 第96-98页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第97页 |
| ·LD-PCR扩增双链cDNA | 第97页 |
| ·ds cDNA的纯化 | 第97-98页 |
| ·酵母双杂交文库的构建及筛选 | 第98-100页 |
| ·重组诱饵质粒pGBKT7/NS1酵母感受态细胞的制备 | 第98-99页 |
| ·脾ds cDNA、pGADT-Rec共转化含pGBKT7/NS1的AH109感受态细胞 | 第99-100页 |
| ·酵母双杂交阳性克隆子的鉴定 | 第100-101页 |
| ·β-半乳糖苷酶印膜法检测lacZ报告基因的表达 | 第100页 |
| ·PCR扩增脾ds cDNA片段、测序、比对分析 | 第100-101页 |
| 3 结果与分析 | 第101-110页 |
| ·NS1基因的扩增、克隆与表达 | 第101-102页 |
| ·NS1基因的序列分析 | 第102页 |
| ·NS1蛋白的表达及western-blotting分析 | 第102-103页 |
| ·重组诱饵质粒pGBKT7/NS1的构建与鉴定 | 第103-104页 |
| ·酵母双杂交重组诱饵质粒的转化及自激活检测 | 第104-105页 |
| ·酵母菌株AH109营养表型的验证 | 第104-105页 |
| ·pGBKT7/NS1转化AH109后的自激活检测 | 第105页 |
| ·pGBKT7/NS1对AH109毒性的检测 | 第105页 |
| ·脾总RNA的提取 | 第105-106页 |
| ·mRNA的分离 | 第106页 |
| ·LD-PCR制备ds cDNA片段 | 第106-107页 |
| ·NS1蛋白互作蛋白的筛选与鉴定 | 第107-110页 |
| ·转化效率的测定 | 第107页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第107-108页 |
| ·β-半乳糖苷酶印膜法检测阳性克隆子 | 第108页 |
| ·阳性克隆子内ds cDNA片段的PCR扩增 | 第108-109页 |
| ·阳性克隆片段的测序与分析 | 第109-110页 |
| 4 讨论 | 第110-114页 |
| ·NS1蛋白与宿主蛋白间的相互作用 | 第110-111页 |
| ·酵母双杂交系统 | 第111-112页 |
| ·ISG12蛋白 | 第112页 |
| ·IRF家族 | 第112-113页 |
| ·AIV的M蛋白 | 第113-114页 |
| ·PPM1F蛋白 | 第114页 |
| 5 小结 | 第114-116页 |
| 第6章 利用细菌双杂交系统和GST融合蛋白沉降技术验证NS1蛋白与ISG12-2和IRF2蛋白的相互作用 | 第116-126页 |
| 1 研究目的与意义 | 第116页 |
| 2 材料与方法 | 第116-120页 |
| ·主要仪器 | 第116页 |
| ·菌株及质粒 | 第116页 |
| ·试剂及配制方法 | 第116-118页 |
| ·细菌双杂交重组捕获质粒pTRG/ISG12和pTRG/IRF的构建与鉴定 | 第118页 |
| ·ISG12-2和IRF2基因的克隆 | 第118页 |
| ·重组捕获质粒pTRG/ISG12和pTRG/IRF的构建与鉴定 | 第118页 |
| ·重组捕获质粒pTRG/ISG12和pTRG/IRF的诱导表达 | 第118页 |
| ·重组诱饵质粒和捕获质粒的共转化及鉴定 | 第118-119页 |
| ·细菌双杂交试验验证NS1蛋白与ISG12-2和IRF2蛋白的互作 | 第119页 |
| ·GST融合蛋白沉降试验验证NS1蛋白与ISG12-2、IRF2的相互作用 | 第119-120页 |
| ·NS1蛋白、ISG12-2和IRF2蛋白的原核表达与纯化 | 第119页 |
| ·GST融合蛋白沉降技术验证NS1蛋白与靶蛋白间的相互作用 | 第119-120页 |
| 3 结果与分析 | 第120-124页 |
| ·ISG12-2和IRF2基因的PCR扩增 | 第120页 |
| ·重组捕获质粒pTRG/ISG12和pTRG/IRF的构建与鉴定 | 第120-121页 |
| ·重组捕获质粒pTRG/ISG12和pTRG/IRF的诱导表达 | 第121-122页 |
| ·重组诱饵质粒和捕获质粒的共转化及鉴定 | 第122页 |
| ·细菌双杂交验证NS1蛋白与ISG12-2、IRF2的相互作用 | 第122-123页 |
| ·ISGl2-2和IRF2的原核表达及纯化 | 第123页 |
| ·GST融合蛋白沉降试验验证NS1蛋白与ISG12-2、IRF2的互作 | 第123-124页 |
| 4 讨论 | 第124-125页 |
| ·NS1蛋白的功能及其互作蛋白 | 第124-125页 |
| ·互作蛋白的进一步验证 | 第125页 |
| 5 小结 | 第125-126页 |
| 参考文献 | 第126-148页 |
| 研究生期间发表的主要论文 | 第148-149页 |
| 致谢 | 第149页 |
