| 摘要 | 第1-14页 |
| ABSTRACT | 第14-18页 |
| 英文缩略词表 | 第18-20页 |
| 引言 | 第20-22页 |
| 上篇 文献综述 | 第22-65页 |
| 第一章 噬菌体抗体库技术研究进展 | 第23-33页 |
| 1 噬菌体抗体库技术的基本原理 | 第23-24页 |
| 2 噬菌体展示技术载体系统的发展 | 第24-26页 |
| ·丝状噬菌体展示系统 | 第24-25页 |
| ·λ噬菌体展示系统 | 第25页 |
| ·T4噬菌体展示系统 | 第25页 |
| ·T7噬菌体展示系统 | 第25-26页 |
| 3 噬菌体抗体库的构建 | 第26-27页 |
| ·抗体可变区基因的获得 | 第26页 |
| ·噬菌体抗体库载体的构建 | 第26-27页 |
| ·抗体可变区基因的表达 | 第27页 |
| 4 噬菌体抗体库的筛选 | 第27-28页 |
| ·固相化或液相抗原筛选法 | 第27页 |
| ·交替筛选法 | 第27-28页 |
| ·双层膜筛选法 | 第28页 |
| ·选择性感染噬菌体筛选系统 | 第28页 |
| 5 噬菌体抗体库的类型 | 第28-30页 |
| ·天然抗体库 | 第29页 |
| ·免疫抗体库 | 第29页 |
| ·化学合成抗体库 | 第29-30页 |
| 6 噬菌体抗体库技术的特点与优势 | 第30页 |
| 7 噬菌体抗体库技术的应用 | 第30-31页 |
| ·噬菌体抗体库技术在生物学、医学等领域的应用 | 第30-31页 |
| ·噬菌体抗体库技术在农兽药等小分子化合物残留检测中的应用 | 第31页 |
| 8 噬菌体抗体库技术的应用前景及存在的问题 | 第31-33页 |
| 第二章 单链抗体及其表达系统研究进展 | 第33-42页 |
| 1 单链抗体的结构及特点 | 第33-34页 |
| 2 单链抗体的构建 | 第34页 |
| 3 单链抗体的应用 | 第34-36页 |
| ·应用于基础理论研究 | 第35页 |
| ·应用于放射性影像分析 | 第35页 |
| ·构建免疫毒素应用于肿瘤治疗 | 第35页 |
| ·应用于细胞内免疫 | 第35-36页 |
| ·应用于构建双特异性抗体等其它基因工程抗体 | 第36页 |
| ·应用于有害物质残留的检测 | 第36页 |
| 4 单链抗体表达系统 | 第36-40页 |
| ·原核表达系统 | 第36-37页 |
| ·真核表达系统 | 第37-39页 |
| ·酵母表达系统 | 第38页 |
| ·昆虫表达系统 | 第38-39页 |
| ·植物表达系统 | 第39页 |
| ·哺乳动物表达系统 | 第39页 |
| ·噬菌体展示系统 | 第39-40页 |
| 5 单链抗体表达策略 | 第40页 |
| 6 单链抗体存在问题及改进方法 | 第40-41页 |
| 7 展望 | 第41-42页 |
| 第三章 农药小分子抗体制备及其免疫分析技术应用研究进展 | 第42-51页 |
| 1 农药多克隆抗体制备技术研究进展 | 第42-43页 |
| 2 农药单克隆抗体制备技术研究进展 | 第43-44页 |
| 3 农药重组抗体制备技术研究进展 | 第44-47页 |
| ·从杂交瘤细胞系制备农药重组抗体 | 第44-45页 |
| ·从抗体库中制备农药重组抗体 | 第45-46页 |
| ·抗体特性体外改造制备农药重组抗体 | 第46-47页 |
| ·农药重组抗体制备技术发展动态 | 第47页 |
| 4 人工模拟抗体制备农药抗体技术研究进展 | 第47-49页 |
| ·传统抗体以外的蛋白来源抗体 | 第47-48页 |
| ·核酸来源抗体 | 第48页 |
| ·小分子物聚合材料抗体 | 第48-49页 |
| 5 农药免疫分析技术应用研究进展 | 第49-50页 |
| ·酶免疫分析法 | 第49页 |
| ·免疫分析芯片的应用 | 第49-50页 |
| ·免疫试纸条的应用 | 第50页 |
| 6 问题与展望 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-65页 |
| 下篇 研究内容 | 第65-149页 |
| 技术路线图 | 第66-67页 |
| 第一章 Balb/c小鼠的免疫及抗血清特性初步分析 | 第67-75页 |
| 1 材料与方法 | 第67-70页 |
| ·材料 | 第67-68页 |
| ·实验动物 | 第67页 |
| ·主要试剂 | 第67-68页 |
| ·主要溶液 | 第68页 |
| ·主要仪器设备 | 第68页 |
| ·方法 | 第68-70页 |
| ·抗原合成 | 第68-69页 |
| ·免疫原的紫外可见光谱鉴定 | 第69页 |
| ·小鼠免疫 | 第69页 |
| ·间接非竞争ELISA测定抗血清效价 | 第69-70页 |
| ·间接非竞争ELISA测定抗血清交叉吸附情况 | 第70页 |
| ·抗原抗体工作浓度的初步确定 | 第70页 |
| ·间接竞争ELISA初步测定抗血清识别甲胺磷的能力 | 第70页 |
| 2 结果与分析 | 第70-72页 |
| ·免疫原的合成和鉴定 | 第70页 |
| ·抗血清效价测定 | 第70-71页 |
| ·交叉识别 | 第71页 |
| ·间接竞争ELISA的抗原抗体工作浓度 | 第71页 |
| ·间接竞争ELISA初步测定 | 第71-72页 |
| 3 讨论 | 第72-74页 |
| 4 小结 | 第74-75页 |
| 第二章 抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建 | 第75-89页 |
| 1 材料与方法 | 第75-84页 |
| ·材料 | 第75-78页 |
| ·菌株及噬菌粒 | 第75-76页 |
| ·主要试剂 | 第76-77页 |
| ·培养基及溶液 | 第77-78页 |
| ·主要仪器 | 第78页 |
| ·方法 | 第78-84页 |
| ·脾细胞的制备 | 第78-79页 |
| ·总细胞RNA的提取 | 第79页 |
| ·mRNA的纯化 | 第79-80页 |
| ·第一链cDNA的合成 | 第80页 |
| ·VH、VL基因的扩增 | 第80页 |
| ·VH、VL基因的纯化回收及定量 | 第80-81页 |
| ·ScFv基因的组装及扩增 | 第81页 |
| ·ScFv基因的纯化回收及定量 | 第81页 |
| ·ScFv的SfiⅠ和Not Ⅰ双酶切 | 第81-82页 |
| ·与噬菌粒pCANTAB5E的连接 | 第82页 |
| ·E.coli TG1电转感受态细胞的制备 | 第82页 |
| ·大肠杆菌的电转化及库容量的测定 | 第82-83页 |
| ·噬菌粒DNA的提取 | 第83-84页 |
| ·转化子PCR及双酶切鉴定 | 第84页 |
| ·抗体库多样性分析 | 第84页 |
| 2 结果与分析 | 第84-87页 |
| ·RNA的提取及鉴定 | 第84页 |
| ·目的基因的扩增及鉴定 | 第84-85页 |
| ·ScFv基因的连接与扩增 | 第85-86页 |
| ·ScFv基因的克隆转化及库容量 | 第86页 |
| ·转化子的PCR鉴定 | 第86页 |
| ·转化子的双酶切鉴定 | 第86页 |
| ·抗体库多样性分析 | 第86-87页 |
| 3 讨论 | 第87-88页 |
| 4 小结 | 第88-89页 |
| 第三章 抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的筛选和鉴定 | 第89-104页 |
| 1 材料与方法 | 第89-96页 |
| ·材料 | 第89-90页 |
| ·菌株、辅助噬菌体及单链抗体库 | 第89-90页 |
| ·主要试剂 | 第90页 |
| ·培养基和溶液 | 第90页 |
| ·主要仪器 | 第90页 |
| ·方法 | 第90-96页 |
| ·辅助噬菌体M13K07的大量制备 | 第90-92页 |
| ·对数生长期E.coli TG1的制备 | 第91页 |
| ·单个噬菌体原种M13K07病毒空斑的制备 | 第91页 |
| ·辅助噬菌体M13K07的扩增 | 第91页 |
| ·辅助噬菌体M13K07的滴度测定 | 第91-92页 |
| ·原始scFv-噬菌体表面展示文库的扩建和滴度测定 | 第92页 |
| ·噬菌体ScFv抗体库的富集筛选 | 第92-94页 |
| ·第一轮富集筛选 | 第92-93页 |
| ·次级噬菌体抗体库的制备和保存 | 第93页 |
| ·次级ScFv-噬菌体表面展示文库的扩建和滴度测定 | 第93页 |
| ·进一步富集筛选 | 第93-94页 |
| ·富集筛选效果的鉴定 | 第94-95页 |
| ·多克隆噬菌体ELISA的初步鉴定 | 第94-95页 |
| ·筛选菌落的PCR鉴定 | 第95页 |
| ·重组噬菌粒的双酶切验证 | 第95页 |
| ·单克隆噬菌体单链抗体的制备 | 第95页 |
| ·单克隆噬菌体ELISA鉴定筛选效率 | 第95页 |
| ·高亲和力阳性噬菌体抗体克隆的筛选 | 第95-96页 |
| ·单克隆噬菌体ELISA筛选试验 | 第95-96页 |
| ·竞争抑制试验 | 第96页 |
| ·高亲合力阳性克隆ScFv基因序列分析 | 第96页 |
| 2 结果与分析 | 第96-100页 |
| ·原始ScFv-噬菌体表面展示文库的扩建 | 第96页 |
| ·噬菌体单链抗体库的富集 | 第96-97页 |
| ·富集筛选效果的分析鉴定 | 第97-98页 |
| ·多克隆噬菌体ELISA的初步分析 | 第97页 |
| ·筛选菌落的PCR鉴定 | 第97页 |
| ·重组噬菌粒的双酶切验证 | 第97-98页 |
| ·筛选效率的比较 | 第98页 |
| ·单克隆噬菌体ELISA筛选高亲和力克隆 | 第98页 |
| ·阳性噬菌体抗体克隆竞争抑制试验结果 | 第98-99页 |
| ·阳性克隆单链抗体基因的序列分析 | 第99-100页 |
| 3 讨论 | 第100-103页 |
| 4 小结 | 第103-104页 |
| 第四章 抗甲胺磷单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达及性质鉴定 | 第104-121页 |
| 1 材料与方法 | 第104-109页 |
| ·材料 | 第104-105页 |
| ·菌株及阳性噬菌体单链抗体克隆 | 第104页 |
| ·主要试剂 | 第104-105页 |
| ·培养基和缓冲液 | 第105页 |
| ·主要仪器 | 第105页 |
| ·方法 | 第105-109页 |
| ·可溶性单链抗体的小量制备及鉴定 | 第105-107页 |
| ·对数生长期E.coli HB2151的制备 | 第105页 |
| ·阳性克隆重组噬菌体的制备 | 第105页 |
| ·阳性克隆噬菌体对E.coli HB2151的感染 | 第105页 |
| ·ScFv的可溶性表达 | 第105-106页 |
| ·不同表达部位产物的提取和浓缩 | 第106页 |
| ·可溶性ScFv的SDS-PAGE检测 | 第106页 |
| ·可溶性ScFv的间接ELISA检测 | 第106-107页 |
| ·间接竞争ELISA初步分析 | 第107页 |
| ·可溶性单链抗体的大量制备和纯化 | 第107-108页 |
| ·可溶性单链抗体的大量制备 | 第107页 |
| ·纯化 | 第107-108页 |
| ·竞争ELISA分析方法的初步建立 | 第108-109页 |
| ·纯化抗体的效价测定 | 第108页 |
| ·抗原抗体工作浓度的测定 | 第108页 |
| ·ELISA标准曲线的建立及灵敏度评价 | 第108页 |
| ·抗体特异性考察 | 第108页 |
| ·精确度试验 | 第108-109页 |
| ·添加回收试验 | 第109页 |
| ·单链抗体稳定性试验 | 第109页 |
| 2 结果与分析 | 第109-116页 |
| ·可溶性单链抗体的小量制备及鉴定 | 第109-112页 |
| ·阳性克隆噬菌体对E.coli HB2151的感染 | 第109-110页 |
| ·ScFv的可溶性表达及检测 | 第110-112页 |
| ·SDS-PAGE检测 | 第110页 |
| ·间接ELISA检测 | 第110-111页 |
| ·间接竞争ELISA分析 | 第111-112页 |
| ·可溶性单链抗体的大量制备和纯化 | 第112-113页 |
| ·纯化抗体ELISA标准曲线的建立及评价 | 第113-115页 |
| ·纯化抗体的效价 | 第113页 |
| ·抗原和抗体的工作浓度 | 第113页 |
| ·ELISA标准曲线的建立及灵敏度评价 | 第113页 |
| ·抗体特异性考察 | 第113-115页 |
| ·精确度试验 | 第115页 |
| ·准确度试验(添加回收) | 第115页 |
| ·单链抗体的稳定性 | 第115-116页 |
| 3 讨论 | 第116-120页 |
| ·关于Met-ScFv可溶性抗体的表达 | 第116-117页 |
| ·关于单链抗体的纯化 | 第117页 |
| ·关于本研究中单链抗体结合特性的分析 | 第117-118页 |
| ·关于Met-ScFv可溶性单链抗体的亲和性和特异性 | 第118-119页 |
| ·关于单链抗体的稳定性 | 第119页 |
| ·关于单链抗体在农药酶联免疫分析上的应用前景 | 第119-120页 |
| 4 小结 | 第120-121页 |
| 第五章 抗甲胺磷单链抗体在巴斯德毕赤酵母中的表达及性质鉴定 | 第121-141页 |
| 1 材料与方法 | 第121-131页 |
| ·材料 | 第121-124页 |
| ·菌种与质粒 | 第121-122页 |
| ·PCR引物 | 第122页 |
| ·主要试剂 | 第122页 |
| ·培养基和溶液 | 第122-124页 |
| ·主要仪器 | 第124页 |
| ·方法 | 第124-131页 |
| ·酵母表达质粒pPICZα C的制备 | 第124页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第124页 |
| ·pPICZα C质粒的转化和质粒菌的扩增培养 | 第124页 |
| ·pPICZα C质粒的提取和定量 | 第124页 |
| ·pPICZα C质粒的单酶切鉴定 | 第124页 |
| ·pPICZα C质粒菌的保存 | 第124页 |
| ·酵母表达载体pPICZα C-ScFv质粒的构建 | 第124-126页 |
| ·阳性克隆菌的扩增培养 | 第124-125页 |
| ·质粒PCANTAB5E-ScFv的提取 | 第125页 |
| ·含内切酶位点的目的基因ScFv的扩增、回收及定量 | 第125页 |
| ·目的片段的双酶切、回收及定量 | 第125页 |
| ·pPICZα C质粒的双酶切、回收及定量 | 第125页 |
| ·目的片段ScFv与pPICZα C的连接、转化 | 第125-126页 |
| ·转化子的PCR鉴定及酶切验证 | 第126页 |
| ·阳性克隆的保存 | 第126页 |
| ·表达载体pPICZα C-ScFv与酵母基因的整合 | 第126-128页 |
| ·重组表达质粒pPICZα C-ScFv的大量提取及定量 | 第126-127页 |
| ·质粒pPICZα C的大量提取及定量 | 第127页 |
| ·pPICZα C和重组质粒pPICZα C-ScFv的线形化与纯化浓缩 | 第127页 |
| ·感受态酵母细胞的制备 | 第127-128页 |
| ·酵母菌株的电转化 | 第128页 |
| ·菌落PCR检测目的基因整合 | 第128页 |
| ·多拷贝Mut~+型转化子的筛选 | 第128-129页 |
| ·多拷贝转化子的筛选 | 第128页 |
| ·多拷贝菌株生长表型的鉴定 | 第128-129页 |
| ·高表达阳性克隆的筛选 | 第129页 |
| ·阳性克隆菌的诱导表达 | 第129页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第129页 |
| ·表达产物的ELISA分析 | 第129页 |
| ·酵母表达条件的初步优化 | 第129-130页 |
| ·诱导表达时间优化 | 第130页 |
| ·不同菌体密度的诱导表达 | 第130页 |
| ·不同pH培养液的诱导表达 | 第130页 |
| ·不同剂量甲醇的诱导表达 | 第130页 |
| ·优化条件下的大量表达 | 第130页 |
| ·目的蛋白浓缩纯化 | 第130-131页 |
| ·酵母表达单链抗体免疫特性初步分析 | 第131页 |
| ·抗原抗体工作浓度确定 | 第131页 |
| ·间接竞争抑制试验 | 第131页 |
| ·抗体特异性测定 | 第131页 |
| ·酵母表达单链抗体稳定性试验 | 第131页 |
| ·表达产物4℃保存条件下的稳定性试验 | 第131页 |
| ·遗传稳定性检测 | 第131页 |
| 2 结果与分析 | 第131-138页 |
| ·重组质粒pPICZα C-ScFv的构建及鉴定 | 第131-132页 |
| ·重组质粒转化毕赤酵母菌X-33及鉴定 | 第132页 |
| ·多拷贝Mut~+型转化子的筛选结果 | 第132页 |
| ·多拷贝Mut~+型转化子的原始诱导表达及鉴定 | 第132-133页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE鉴定 | 第132-133页 |
| ·表达产物的ELISA鉴定及最佳诱导时间 | 第133页 |
| ·酵母表达条件的初步优化 | 第133-135页 |
| ·最佳诱导菌体密度 | 第133-134页 |
| ·最佳诱导pH值 | 第134页 |
| ·最佳诱导甲醇剂量 | 第134-135页 |
| ·抗体的优化表达及纯化 | 第135页 |
| ·酵母表达单链抗体化学免疫特性初步分析 | 第135-137页 |
| ·抗原和抗体的工作浓度 | 第135页 |
| ·酵母表达抗甲胺磷单链抗体抑制曲线 | 第135-136页 |
| ·抗体特异性考察 | 第136-137页 |
| ·酵母表达单链抗体的稳定性 | 第137-138页 |
| ·4℃保存条件下的稳定性 | 第137-138页 |
| ·遗传稳定性 | 第138页 |
| 3 讨论 | 第138-141页 |
| 4 小结 | 第141页 |
| 参考文献 | 第141-149页 |
| 总结、创新点及展望 | 第149-151页 |
| 致谢 | 第151-153页 |
| 攻读博士学位期间发表论文 | 第153页 |
