| 符号说明 | 第1-11页 |
| 中文摘要 | 第11-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 1. 引言 | 第14-30页 |
| ·玉米纹枯病研究进展 | 第14-20页 |
| ·症状 | 第15页 |
| ·病原菌 | 第15-16页 |
| ·病原的种类和融合群 | 第15页 |
| ·病原的生理生态和生物学特性 | 第15-16页 |
| ·玉米纹枯病病原的致病因子及侵染途径 | 第16-17页 |
| ·致病因子 | 第16-17页 |
| ·侵染途径 | 第17页 |
| ·玉米纹枯病的发病规律及防治措施 | 第17-20页 |
| ·发病规律 | 第17页 |
| ·防治措施 | 第17-19页 |
| ·清除病原菌菌丝和菌核 | 第18页 |
| ·栽培防治 | 第18页 |
| ·药物防治 | 第18页 |
| ·生物防治 | 第18-19页 |
| ·玉米纹枯病抗病机制及抗病种质资源的筛选研究 | 第19-20页 |
| ·抗病机制 | 第19-20页 |
| ·植物抗病基因 | 第19页 |
| ·植物防卫反应 | 第19-20页 |
| ·抗病种质资源筛选 | 第20页 |
| ·病原真菌的致病性研究进展 | 第20-23页 |
| ·立枯丝核菌胞壁降解酶-纤维素酶的研究进展 | 第23-27页 |
| ·纤维素酶系的组成 | 第23页 |
| ·纤维素酶的催化机制 | 第23-24页 |
| ·纤维素酶基因的克隆 | 第24-27页 |
| ·纤维素酶基因的表达 | 第27页 |
| ·选题的立题依据、研究内容、技术路线 | 第27-30页 |
| ·选题的立题依据 | 第27-28页 |
| ·研究内容 | 第28-29页 |
| ·技术路线 | 第29-30页 |
| 2. 材料与方法 | 第30-64页 |
| ·材料 | 第30-34页 |
| ·供试菌株 | 第30页 |
| ·菌株和质粒 | 第30页 |
| ·主要生化和分子生物学试剂、酶 | 第30-31页 |
| ·仪器 | 第31页 |
| ·培养基 | 第31页 |
| ·溶液配制 | 第31-34页 |
| ·基因克隆 | 第34-51页 |
| ·立枯丝核菌β-1,4-内切纤维素酶的基因克隆及序列分析 | 第34-48页 |
| ·PCR 引物设计 | 第34-38页 |
| ·立枯丝核菌总RNA 的提取（Tranzol 法） | 第38页 |
| ·紫外检测RNA 产率和纯度 | 第38页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第38-39页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶基因cDNA 中间片段的分离 | 第39-43页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶基因cDNA 中间片段的扩增 | 第39-40页 |
| ·PCR 产物回收 | 第40-41页 |
| ·与载体连接 | 第41页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第41-42页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第41-42页 |
| ·大肠杆菌感受态的转化 | 第42页 |
| ·重组质粒的筛选与鉴定 | 第42-43页 |
| ·菌落PCR 检测 | 第42-43页 |
| ·序列测定 | 第43页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因3’末端的分离 | 第43-44页 |
| ·Rhizoctonia .solani β-1,4-内切纤维素酶基因5’末端的分离 | 第44-47页 |
| ·菌丝体DNA 的抽提 | 第44-45页 |
| ·Rhizoctonia .solani β-1,4-内切纤维素酶基因的5’-TAIL 扩增 | 第45-47页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因全长cDNA 和DNA 的克隆 | 第47-48页 |
| ·Rhizoctonia .solani β-1,4-内切纤维素酶基因全长序列的生物信息学分析 | 第48页 |
| ·Rhizoctonia solani beta-tubulin 基因的克隆 | 第48-51页 |
| ·PCR 引物设计 | 第48-50页 |
| ·beta-tubulin 基因的扩增 | 第50-51页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因的表达分析 | 第51页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶基因在玉米中的表达情况 | 第51页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶基因在不同诱导底物中的表达情况 | 第51页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第51-61页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因序列的限制性酶切位点分析 | 第51页 |
| ·表达引物设计 | 第51-53页 |
| ·质粒提取 | 第53-54页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第54-55页 |
| ·序列测定 | 第55页 |
| ·线性化质粒DNA 的制备 | 第55-56页 |
| ·线状质粒DNA 的脱磷酸化处理 | 第56页 |
| ·酵母转化（电击法） | 第56-57页 |
| ·pichia pastoris GS115 感受态细胞的制备 | 第56-57页 |
| ·重组表达质粒pPIC9K | 第57页 |
| ·酵母转化子的筛选与鉴定 | 第57-59页 |
| ·酵母转化子甲醇利用表型的平板筛选 | 第57页 |
| ·酵母转化子的PCR 鉴定 | 第57-59页 |
| ·pPIC9K AOX1 通用引物鉴定 | 第57-58页 |
| ·Rhizoctonia solani EG-1 和EG-2 基因的特异性引物鉴定 | 第58-59页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第59-60页 |
| ·酵母工程菌的培养和β-1,4-内切纤维素酶的诱导分泌表达 | 第60-61页 |
| ·表达产物的生物学活性检测 | 第61页 |
| ·表达产物β-1,4-内切纤维素酶的SDS-PAGE 分析 | 第61页 |
| ·表达β-1,4-内切纤维素酶工程菌产酶曲线的测定 | 第61页 |
| ·巴斯德毕赤酵母分泌表达产物的纯化 | 第61-63页 |
| ·发酵液的制备 | 第61页 |
| ·硫酸铵沉淀 | 第61页 |
| ·Ni-NTA 亲和层析纯化 | 第61-62页 |
| ·蛋白质分子量测定和纯度鉴定 | 第62-63页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第62页 |
| ·电泳迁移率的计算和标准曲线的制作 | 第62页 |
| ·分子量测定 | 第62-63页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第63页 |
| ·重组表达β-1,4-内切纤维素酶的酶学性质研究 | 第63-64页 |
| ·反应最适温度 | 第63页 |
| ·反应最适pH 值 | 第63页 |
| ·重组表达β-1,4-内切纤维素酶的底物特异性 | 第63页 |
| ·重组表达β-1,4-内切纤维素酶的致病性研究 | 第63-64页 |
| 3. 结果与分析 | 第64-107页 |
| ·Rhizoctonia solani 总RNA 的提取 | 第64页 |
| ·基因克隆 | 第64-87页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因的克隆 | 第64-85页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因中间片段的分离 | 第64-65页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因3’末端cDNA 的分离 | 第65-66页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因cDNA 5’末端的分离 | 第66-67页 |
| ·Rhizoctonia solaniβ-1,4-内切纤维素酶基因ORF cDNA 的分离及扩增片断的序列拼接 | 第67-68页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因Genomic DNA 的扩增 | 第68-69页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列分析 | 第69-73页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因的核苷酸序列分析 | 第73-74页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因的氨基酸序列分析 | 第74-78页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因的结构域分析 | 第78-79页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶的氨基酸组成 | 第79-81页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶的立体结构预测 | 第81-82页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因的结构及加工后的修饰分析 | 第82页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因的同源性比较 | 第82-85页 |
| ·beta-tubulin 基因的克隆 | 第85页 |
| ·Rhizoctonia solani beta-tubulin 基因核苷酸序列和推测的氨基酸序列分析 | 第85-86页 |
| ·Rhizoctonia solani beta-tubulin 基因的结构域分析 | 第86-87页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因的表达分析 | 第87-91页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶基因在玉米中的表达情况 | 第87-89页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶基因在不同诱导底物中的表达情况 | 第89-91页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第91-102页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶基因序列的限制性酶切位点分析 | 第91页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因成熟肽序列的扩增 | 第91-93页 |
| ·Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第93-102页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第93-97页 |
| ·酵母表达载体pPIC9K 的分析 | 第93-94页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第94-97页 |
| ·重组酵母表达质粒转化Pichia pastoris GS115 及酵母转化子的筛选 | 第97-100页 |
| ·酵母转化子甲醇利用表型的筛选 | 第97-98页 |
| ·酵母转化子的PCR 鉴定 | 第98-99页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子的筛选 | 第99-100页 |
| ·外源基因在P. pastoris 中的高效表达及表达产物的检测 | 第100-102页 |
| ·外源基因在P. pastoris 中的诱导表达和高效表达酵母菌株的筛选 | 第100页 |
| ·Rhizoctonia solani 酵母工程菌PEG-45 产酶曲线的测定 | 第100-101页 |
| ·重组表达产物β-1,4-内切纤维素酶的SDS-PAGE 检测 | 第101-102页 |
| ·重组表达产物β-1,4-内切纤维素酶的纯化 | 第102-103页 |
| ·镍柱亲和层析 | 第102页 |
| ·重组表达产物β-1,4-内切纤维素酶的纯化过程总表 | 第102-103页 |
| ·重组表达产物β-1,4-内切纤维素酶的分子量和纯度鉴定 | 第103页 |
| ·重组表达Rhizoctonia solani β-1,4-内切纤维素酶的酶学性质研究 | 第103-105页 |
| ·重组表达β-1,4-内切纤维素酶的最适反应温度 | 第103-104页 |
| ·重组表达β-1,4-内切纤维素酶的最适反应pH 值 | 第104页 |
| ·重组表达β-1,4-内切纤维素酶对不同底物活性的测定 | 第104-105页 |
| ·重组表达β-1,4-内切纤维素酶对玉米的致病性研究 | 第105-107页 |
| 4. 讨论 | 第107-112页 |
| ·玉米纹枯病菌β-1,4-内切纤维素酶的基因克隆 | 第107页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶基因的结构 | 第107-108页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶基因的表达分析 | 第108页 |
| ·β-1,4-内切纤维素酶在毕赤酵母中的表达 | 第108-110页 |
| ·表达载体构建 | 第108页 |
| ·线性化对转化效率的影响 | 第108-109页 |
| ·影响外源基因高效表达的原因 | 第109页 |
| ·外源基因的特性 | 第109页 |
| ·基因的拷贝数 | 第109页 |
| ·培养条件 | 第109页 |
| ·蛋白的翻译及加工 | 第109-110页 |
| ·重组表达β-1,4-内切纤维素酶的纯化和性质研究 | 第110-111页 |
| ·重组表达β-1,4-内切纤维素酶对玉米的致病性分析 | 第111-112页 |
| 5. 结论与建议 | 第112-114页 |
| ·结论 | 第112页 |
| ·建议 | 第112-114页 |
| 参考文献 | 第114-125页 |
| 致谢 | 第125-126页 |
| 硕士学位论文内容简介及自评 | 第126页 |
