| 摘要 | 第1-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 引言 | 第14-17页 |
| 第一部分 文献综述 | 第17-47页 |
| 第一章 传染性法氏囊病病毒研究现状 | 第17-30页 |
| 1 IBDV发现历史 | 第17-18页 |
| 2 病毒学分类地位 | 第18页 |
| 3 基因组结构及编码蛋白功能 | 第18-23页 |
| ·5’-NCR和3’-NCR | 第18-20页 |
| ·VP1蛋白 | 第20页 |
| ·pVP2、VP2与4条多肽 | 第20-21页 |
| ·VP3蛋白 | 第21-22页 |
| ·VP4蛋白 | 第22-23页 |
| ·VP5蛋白 | 第23页 |
| 4 病毒复制及分子机制 | 第23-26页 |
| ·IBDV的宿主细胞 | 第23-24页 |
| ·病毒复制的分子机制 | 第24-26页 |
| 5 IBDV致病机理与细胞凋亡 | 第26-28页 |
| 6 抗原与毒力变异 | 第28页 |
| 7 拯救技术在IBDV的研究中的应用 | 第28-29页 |
| 8 小结 | 第29-30页 |
| 第二章 基因表达系列分析及相关技术研究进展 | 第30-47页 |
| 1 SAGE技术的原理 | 第31-34页 |
| 2 SAGE文库构建方法的改进 | 第34页 |
| 3 SAGE标签的注释 | 第34-38页 |
| ·注释策略 | 第34-36页 |
| ·未注释标签的进一步分析 | 第36-38页 |
| 4 SAGE文库之间差异比较 | 第38页 |
| 5 SAGE获得的表达差异基因的进一步实验分析 | 第38-39页 |
| ·Northern杂交分析 | 第38-39页 |
| ·半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR | 第39页 |
| ·基因芯片 | 第39页 |
| 6.SAGE-like技术 | 第39-44页 |
| ·3’SAGE和5’SAGE | 第39页 |
| ·CAGE | 第39-40页 |
| ·GIS | 第40-41页 |
| ·SAGE与ChiP联用 | 第41-42页 |
| ·DK和MSDK | 第42-43页 |
| ·DACS | 第43页 |
| ·其他 | 第43-44页 |
| 7 SAGE及相关技术的应用 | 第44-46页 |
| ·转录组研究 | 第44-45页 |
| ·基因表达差异研究 | 第45-46页 |
| ·发现新基因 | 第46页 |
| 8 结束语 | 第46-47页 |
| 第二部分 研究内容 | 第47-135页 |
| 第一章 传染性法氏囊病病毒NB株基因组A节段全长CDNA克隆 | 第47-62页 |
| 1 材料和方法 | 第48-50页 |
| ·载体、菌株、病毒株与SPF种蛋 | 第48页 |
| ·病毒的增殖、纯化与电镜观察 | 第48页 |
| ·IBDV基因组dsRNA的提取 | 第48页 |
| ·引物设计和合成 | 第48-49页 |
| ·Long accurate(LA)-PCR扩增基因组A节段全长cDNA | 第49页 |
| ·IBDV基因组A节段全长cDNA的T-A克隆 | 第49-50页 |
| ·序列测定及分析 | 第50页 |
| 2 结果 | 第50-58页 |
| ·病毒粒子观察与病毒基因组dsRNA提取 | 第50-52页 |
| ·IBDV基因组A节段的克隆与鉴定 | 第52-53页 |
| ·序列测定结果 | 第53页 |
| ·序列分析 | 第53-58页 |
| 3 讨论 | 第58-62页 |
| ·一步法LA-PCR克隆IBDV基因组A节段全长cDNA方法的建立 | 第58-59页 |
| ·VP5蛋白 | 第59-60页 |
| ·多聚蛋白(VP2/4/3) | 第60页 |
| ·关于IBDV抗原变异和毒力变异的分子基础 | 第60-61页 |
| ·关于NB株与其它毒株的亲缘关系 | 第61-62页 |
| 第二章 传染性法氏囊病毒感染前后VERO细胞基因表达差异分析 | 第62-84页 |
| 1 材料和方法 | 第63-72页 |
| ·细胞培养与病毒感染 | 第63页 |
| ·细胞总RNA与mRNA分离 | 第63-64页 |
| ·ds cDNA合成 | 第64-65页 |
| ·NlaⅢ酶切双链cDNA | 第65页 |
| ·Linker与结合在磁珠上的cDNA连接 | 第65-66页 |
| ·MmeⅠ酶切获得cDNA标记物 | 第66页 |
| ·获得130-bp双标签 | 第66-68页 |
| ·双标签分离 | 第68-69页 |
| ·串联体产生 | 第69-70页 |
| ·串联子pZErO-1载体克隆 | 第70-71页 |
| ·Screening of Clones | 第71页 |
| ·序列测定与LongSAGE数据分析 | 第71-72页 |
| 2 结果 | 第72-81页 |
| ·IBDV感染检测及细胞mRNA的分离 | 第72页 |
| ·LongSAGE文库的构建及校验 | 第72-76页 |
| ·测序结果及数据分析 | 第76-81页 |
| 3 讨论 | 第81-84页 |
| ·选用LongSAGE技术依据及其文库构建 | 第81-82页 |
| ·利用人类cDNA、UniGene数据注释标签 | 第82页 |
| ·IBDV感染细胞基因表达谱特征 | 第82-84页 |
| 第三章 传染性法氏囊病病毒A节段或VP2/4/3基因转化的VERO细胞基因表达差异分析 | 第84-108页 |
| 1 材料和方法 | 第85-91页 |
| ·抗体与试剂 | 第85页 |
| ·真核表达载体构建 | 第85页 |
| ·细胞培养、质粒转染及单细胞克隆 | 第85-87页 |
| ·克隆化细胞的PCR和Southern blot鉴定 | 第87-89页 |
| ·RT-PCR和Northern blot检测 | 第89页 |
| ·A节段编码蛋白在克隆化细胞中的表达 | 第89-90页 |
| ·DNA裂解分析和Caspase-3活性分析 | 第90页 |
| ·Vero-A和Vero-VP2/4/3细胞LongSAGE文库构建 | 第90-91页 |
| ·文库标签提取与库间差异分析 | 第91页 |
| 2 结果 | 第91-105页 |
| ·真核表达载体构建 | 第91页 |
| ·G418阳性细胞筛选与克隆 | 第91-92页 |
| ·转入基因在克隆化细胞基因组中的整合分析 | 第92-93页 |
| ·转入基因在克隆化细胞中的转录分析 | 第93-94页 |
| ·转入基因表达产物在克隆化细胞中检测 | 第94-95页 |
| ·DNA裂解分析和Caspase-3活性分析 | 第95-96页 |
| ·Vero-A和Vero-VP2/4/3细胞LongSAGE文库构建 | 第96-97页 |
| ·测序结果及数据分析 | 第97-105页 |
| 3 讨论 | 第105-108页 |
| ·细胞系的建立 | 第105页 |
| ·VP2和VP5蛋白表达与细胞凋亡 | 第105-107页 |
| ·A节段NCRs的功能 | 第107-108页 |
| 第四章 表达传染性法氏囊病毒VP5蛋白的VERO细胞系建立及其转录本分析 | 第108-122页 |
| 1 材料与方法 | 第108-110页 |
| ·pCI-neo-VP5和pEGFP-VP5质粒构建 | 第108-109页 |
| ·Vero细胞培养、质粒转染及克隆 | 第109页 |
| ·单克隆细胞株PCR和Southern blot鉴定 | 第109页 |
| ·单克隆细胞株RT-PCR和Northern blot鉴定 | 第109页 |
| ·IPMA和IFA检测VP5蛋白表达 | 第109页 |
| ·VP5蛋白表达免疫胶体金定位 | 第109-110页 |
| ·Vero-VP5细胞LongSAGE文库构建 | 第110页 |
| ·文库标签提取与文库差异分析 | 第110页 |
| 2.结果 | 第110-120页 |
| ·VP5真核表达载体的构建 | 第110页 |
| ·克隆化细胞系的建立 | 第110-111页 |
| ·VP5基因在克隆化细胞基因组中的整合分析 | 第111-112页 |
| ·VP5基因在克隆化细胞中转录分析 | 第112页 |
| ·VP5蛋白在Vero细胞中的表达 | 第112-114页 |
| ·VP5蛋白在Vero细胞中的表达定位 | 第114-115页 |
| ·Vero-VP5细胞LongSAGE文库的构建 | 第115-116页 |
| ·测序结果及初步数据分析 | 第116-120页 |
| 3 讨论 | 第120-122页 |
| ·细胞系的建立 | 第120页 |
| ·VP5蛋白功能 | 第120-122页 |
| 第五章 表达传染性法氏囊病毒PVP2及其截短突变体蛋白的VERO细胞系的建立 | 第122-130页 |
| 1 材料与方法 | 第123-124页 |
| ·构建IBDV VP2系列真核表达载体 | 第123页 |
| ·Vero细胞培养及质粒转染和单细胞克隆 | 第123-124页 |
| ·单克隆细胞株PCR和Southern blot分析 | 第124页 |
| ·RT-PCR和Northern blot检测 | 第124页 |
| ·IPAM和IFA检测VP2蛋白表达 | 第124页 |
| 2 结果 | 第124-127页 |
| ·IBDV VP2系列重组质粒的构建 | 第124-125页 |
| ·G418抗性细胞筛选与克隆 | 第125页 |
| ·VP2基因在克隆化Vero细胞基因组中的整合分析 | 第125-126页 |
| ·克隆化细胞系中IBDV VP2基因mRNA转录检测 | 第126-127页 |
| ·Vero细胞中VP2蛋白表达 | 第127页 |
| 3 讨论 | 第127-130页 |
| 第六章 表达传染性法氏囊病毒VP3蛋白的VERO细胞系的建立 | 第130-135页 |
| 1 材料和方法 | 第131页 |
| ·pCI-neo-VP3真核表达载体的构建 | 第131页 |
| ·Vero细胞培养及质粒的转染和单细胞克隆 | 第131页 |
| ·单克隆细胞株的PCR和Southern blot鉴定 | 第131页 |
| ·RT-PCR和Northern blot检测单克隆细胞株的mRNA转录 | 第131页 |
| ·IPMA检测VP3蛋白表达 | 第131页 |
| 2 结果 | 第131-133页 |
| ·真核表达载体构建 | 第131-132页 |
| ·克隆化细胞系的建立 | 第132页 |
| ·VP3基因在克隆化Vero细胞基因组中的整合分析与mRNA转录分析 | 第132-133页 |
| ·VP3蛋白在Vero细胞中表达 | 第133页 |
| 3 讨论 | 第133-135页 |
| 全文总结 | 第135-136页 |
| 附表 | 第136-152页 |
| 参考文献 | 第152-167页 |
| 第三部分 附录 | 第167-177页 |
| 附录A 常用试剂及仪器 | 第167-169页 |
| 附录B 常用缓冲液及培养基配方 | 第169-176页 |
| 附录C 攻博期间发表或录用的学术论文 | 第176-177页 |
| 致谢 | 第177页 |
