| 第一章 大肠杆菌碱性磷酸酶结构与功能的研究 | 第1-31页 |
| 1 概述 | 第15页 |
| 2 大肠杆菌碱性磷酸酶的结构及活性中心的构成 | 第15-17页 |
| 3 大肠杆菌碱性磷酸酶的催化机制及反应机理 | 第17-19页 |
| 4 大肠杆菌碱性磷酸酶结构与功能的研究现状 | 第19-24页 |
| ·EAP活性中心Zn~(2+)配位氨基酸对催化功能的影响 | 第19-21页 |
| ·EAP活性中心Mg~(2+)配位氨基酸对催化功能的影响 | 第21页 |
| ·EAP活性中心Zn~(2+)和Mg~(2+)配位氨基酸对催化功能的影响 | 第21页 |
| ·E AP活性中心磷酸基团配位氨基酸对催化功能的影响 | 第21-23页 |
| ·磷酸基团直接配位氨基酸 | 第21-22页 |
| ·磷酸基团间接配位氨基酸 | 第22-23页 |
| ·非活性中心氨基酸对催化功能的影响 | 第23-24页 |
| 5 结束语 | 第24-25页 |
| 参考文献 | 第25-31页 |
| 第二章 目的基因在大肠杆菌中高效表达的调控机制 | 第31-45页 |
| 1 概述 | 第31页 |
| 2 转录水平的调控 | 第31-32页 |
| ·启动子 | 第31-32页 |
| ·终止子 | 第32页 |
| 3 翻译水平的调控 | 第32-33页 |
| ·翻译的起始 | 第32-33页 |
| ·翻译的终止 | 第33页 |
| ·m RNA的稳定性 | 第33页 |
| 4 密码子的偏好性 | 第33-34页 |
| 5 包涵体形成的抑制 | 第34页 |
| 6 融合蛋白质 | 第34-35页 |
| 7 目的蛋白质的定位 | 第35-36页 |
| ·细胞质 | 第35页 |
| ·周质空间 | 第35-36页 |
| ·细胞外 | 第36页 |
| 8 结束语 | 第36-37页 |
| 参考文献 | 第37-45页 |
| 第三章 大肠杆菌碱性磷酸酶的定向分子进化 | 第45-93页 |
| 摘要 | 第45-46页 |
| 引言 | 第46-49页 |
| 材料与方法 | 第49-63页 |
| 1 材料 | 第49-53页 |
| ·菌株与质粒 | 第49-53页 |
| ·培养基 | 第53页 |
| ·材料与方法 | 第53页 |
| 2 实验方法 | 第53-63页 |
| ·大肠杆菌质粒的提取 | 第53页 |
| ·Error-prone PCR扩增phoA基因 | 第53-55页 |
| ·突变文库的构建及筛选 | 第55-56页 |
| ·含有突变基因的质粒文库的构建 | 第55页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第55页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第55页 |
| ·文库的筛选 | 第55-56页 |
| ·大肠杆菌碱性磷酸酶高比活菌株DNA序列测定 | 第56页 |
| ·大肠杆菌碱性磷酸酶突变体表达载体的构建 | 第56-58页 |
| ·大肠杆菌碱性磷酸酶突变体表达量及比活的分析 | 第58-59页 |
| ·Real-time PCR分析E.coli SM547/pEK 48-1-WT | 第59-60页 |
| ·pEK 48系列各突变体二级结构分析 | 第60页 |
| ·大肠杆菌碱性磷酸酶的表达,提取及纯化 | 第60-61页 |
| ·SDS-PAGE分析蛋白质纯度及分子量 | 第61页 |
| ·蛋白质的浓度测定 | 第61页 |
| ·野生型和突变型大肠杆菌碱性磷酸酶的催化动力学研究 | 第61-62页 |
| ·酶活的测定及pH值对稳态动力学常数的影响 | 第61-62页 |
| ·无机磷酸盐对酶促反应的抑制 | 第62页 |
| ·Mg~(2+)对大肠杆菌碱性磷酸酶活力的影响 | 第62-63页 |
| 结果与分析 | 第63-83页 |
| 1 大肠杆菌碱性磷酸酶的体外进化实验设计和突变文库的筛选 | 第63页 |
| ·大肠杆菌碱性磷酸酶的体外进化实验设计 | 第63页 |
| ·Error-prone PCR结果 | 第63页 |
| 2 大肠杆菌碱性磷酸酶高比活菌株34-812的序列测定与分析 | 第63-66页 |
| 3 大肠杆菌碱性磷酸酶突变体表达载体的构建 | 第66-68页 |
| 4 大肠杆菌碱性磷酸酶突变体表达量及比活的分析 | 第68-72页 |
| 5 Real-time PCR分析E.coli SM547/pEK 48-1-WT | 第72-74页 |
| 6 pEK 48系列各突变体二级结构的分析 | 第74-77页 |
| 7 大肠杆菌碱性磷酸酶的表达,提取及纯化 | 第77-78页 |
| ·大肠杆菌碱性磷酸酶的表达和提取 | 第77页 |
| ·大肠杆菌碱性磷酸酶的纯化 | 第77-78页 |
| 8 野生型和突变型大肠杆菌碱性磷酸酶的催化动力学研究 | 第78-82页 |
| ·突变酶K328Q动力学结果分析 | 第78页 |
| ·pH值对稳态动力学常数的影响 | 第78-79页 |
| ·无机磷酸盐对酶促反应的抑制 | 第79-82页 |
| 9 Mg~(2+)对大肠杆菌碱性磷酸酶活力的影响 | 第82-83页 |
| 讨论 | 第83-88页 |
| 1 启动子的基本组成及特性 | 第83页 |
| 2 phoA基因启动子-11位A→G的突变提高启动子效率的机理分析 | 第83-84页 |
| 3 Real-time PCR分析phoA基因m RNA丰度 | 第84-85页 |
| ·Real-time PCR基本原理及方法优势 | 第84页 |
| ·Real-time PCR实验结果及数据分析 | 第84-85页 |
| ·Real-time PCR数据可靠性的分析 | 第85页 |
| 4 在翻译水平影响蛋白质表达的主要因素 | 第85-86页 |
| 5 信号肽序列的同义突变对蛋白质表达水平的影响 | 第86页 |
| 6 phoA结构基因突变氨基酸分析 | 第86-88页 |
| 小结 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-93页 |
| 第四章 大肠杆菌碱性磷酸酶的高效表达及纯化 | 第93-119页 |
| 摘要 | 第93-94页 |
| 引言 | 第94-96页 |
| 材料与方法 | 第96-101页 |
| 1 材料 | 第96-97页 |
| ·菌株与质粒 | 第96-97页 |
| ·培养基及配方 | 第97页 |
| ·试剂与材料 | 第97页 |
| 2 实验方法 | 第97-101页 |
| ·大肠杆菌质粒的提取 | 第97页 |
| ·表达载体pASK75-O-4-186-L-S I的构建 | 第97-98页 |
| ·表达载体pASK75-O-4-186-L-S II的构建 | 第98-99页 |
| ·表达载体pASK75-P-4-186-L-S II的构建 | 第99页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第99页 |
| ·蛋白质诱导表达条件的优化 | 第99-100页 |
| ·培养温度和诱导温度的影响 | 第99页 |
| ·诱导物浓度的影响 | 第99页 |
| ·诱导时间的影响 | 第99-100页 |
| ·诱导前细胞生长状态的影响 | 第100页 |
| ·信号肽的使用 | 第100页 |
| ·细胞各个不同部分及不同类型蛋白质的提取 | 第100页 |
| ·SDS-PAGE 分析蛋白质 | 第100-101页 |
| 结果与分析 | 第101-113页 |
| 1 表达载体pASK75-O-4-186-L-S I的构建 | 第101-102页 |
| 2 表达载体pASK75-O-4-186-L-S II的构建 | 第102-103页 |
| 3 表达载体pASK75-P-4-186-L-S II的构建 | 第103-104页 |
| 4 目的蛋白质表达条件的优化 | 第104-113页 |
| ·培养温度和诱导温度的选择 | 第104-105页 |
| ·诱导物浓度的选择 | 第105-107页 |
| ·加入诱导物时细胞OD_(595)值的选择 | 第107-109页 |
| ·诱导时间的优化 | 第109-111页 |
| ·信号肽的使用 | 第111-113页 |
| 讨论 | 第113-116页 |
| 1 分泌表达融合蛋白质的优点 | 第113页 |
| 2 利用pASK75表达载体分泌表达大肠杆菌碱性磷酸酶的特点和优势 | 第113-114页 |
| 3 影响EAP在周质空间大量可溶表达的因素及抑制包涵体产生的原因推断 | 第114-115页 |
| 4 使用Strep-tag进行亲合纯化的优势 | 第115-116页 |
| 小结 | 第116-117页 |
| 参考文献 | 第117-119页 |
| 第五章 大肠杆菌碱性磷酸酶亲合肽筛选系统的建立 | 第119-135页 |
| 摘要 | 第119-120页 |
| 引言 | 第120-122页 |
| 材料与方法 | 第122-126页 |
| 1 材料 | 第122-123页 |
| ·菌株与质粒 | 第122-123页 |
| ·培养基及配方 | 第123页 |
| ·试剂与材料 | 第123页 |
| 2 实验方法 | 第123-126页 |
| ·大肠杆菌质粒的提取 | 第123页 |
| ·表达载体pASK75-P-4-186-L-SBP-tag的构建 | 第123-124页 |
| ·表达载体pASK75-P-4-186-L-N9和pASK75-P-4-186-L-N15 的构建 | 第124页 |
| ·融合蛋白质表达,提取和纯化 | 第124页 |
| ·融合蛋白质酶活及动力学性质的分析 | 第124页 |
| ·亲合肽筛选系统的验证 | 第124-126页 |
| 结果与分析 | 第126-130页 |
| 1 表达载体pASK75-P-4-186-L-SBP-tag的构建 | 第126页 |
| 2 表达载体pASK75-P-4-186-L-N_9和pASK75-P-4-186-L-N_(15)的构建 | 第126页 |
| 3 五种融合蛋白质表达、提取、纯化及酶学特性分析 | 第126-127页 |
| 4 三种融合蛋白质酶活动力学性质的分析 | 第127页 |
| 5 亲合肽筛选系统的验证 | 第127-130页 |
| 讨论 | 第130-132页 |
| 1 亲合肽筛选系统构建的依据和必要性 | 第130页 |
| 2 高效亲合肽筛选系统的特点和优势 | 第130-132页 |
| ·定向融合的优点 | 第130-131页 |
| ·高灵敏度度,特异性和多样性的原因分析 | 第131页 |
| ·大肠杆菌碱性磷酸酶作为报告基因的优势 | 第131-132页 |
| 小结 | 第132-133页 |
| 参考文献 | 第133-135页 |
| 第六章 结论 | 第135-136页 |
| 发表和待发表的文章 | 第136-137页 |
| 致谢 | 第137页 |
