| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第一章 引言 | 第11-35页 |
| 第一节 白斑综合征病毒(WSSV) 蛋白质组学和分子病毒学研究 | 第11-23页 |
| 1. WSSV 主要结构和功能蛋白的研究 | 第11-14页 |
| 2. WSSV 病毒粒子提取和纯化方法 | 第14-16页 |
| 3. WSSV 基因组研究及地理株间的差异 | 第16-20页 |
| 4. 参与病毒感染过程的相关蛋白研究 | 第20-23页 |
| 第二节 白斑综合征病毒(WSSV)的研究背景 | 第23-29页 |
| 1. 发现新的对虾病毒病原 | 第23页 |
| 2. 人工感染克氏原螯虾,确定增殖WSSV 的动物模型 | 第23-24页 |
| 3. WSSV 病原的检测 | 第24页 |
| 4. WSSV 的宿主范围调查 | 第24页 |
| 5. 承担973 项目相关课题 | 第24-29页 |
| ·病毒粒子纯化 | 第25页 |
| ·对虾组织原代培养及结合现象观察 | 第25-27页 |
| ·结合特异性分析 | 第27页 |
| ·多种条件处理对病毒结合活性的影响 | 第27-29页 |
| 第三节 动物病毒细胞受体研究及应用 | 第29-35页 |
| 1 病毒与受体的关系 | 第29-31页 |
| ·不同病毒会选择同一受体 | 第29页 |
| ·有时同一病毒可与一个以上受体结合 | 第29页 |
| ·不同科的病毒选择不同的受体,同一属的病毒也会选择完全不同的受体作为吸附细胞的作用位点 | 第29-31页 |
| 2 病毒与受体的相互作用启动了病毒的生命循环 | 第31-33页 |
| ·病毒与受体的结合 | 第31页 |
| ·病毒侵入宿主细胞 | 第31-33页 |
| 3 确定病毒受体的研究方法 | 第33-34页 |
| ·直接观察法 | 第33-34页 |
| ·分子生物学方法 | 第34页 |
| 4 动物病毒受体的研究应用 | 第34-35页 |
| 第二章 白斑综合征病毒(WSSV)与宿主细胞相互作用的初步研究 | 第35-54页 |
| 第一节 地高辛标记白斑综合征病毒(WSSV)及其与宿主细胞间结合现象观察 | 第35-46页 |
| 1 材料和方法 | 第36-39页 |
| ·材料 | 第36-37页 |
| ·病毒提纯及标记 | 第37页 |
| ·地高辛标记产量测定 | 第37-38页 |
| ·地高辛标记病毒感染活性验证 | 第38页 |
| ·对虾细胞原代培养 | 第38页 |
| ·病毒-细胞结合现象观察 | 第38-39页 |
| ·梯度稀释DIG 标记WSSV 结合试验 | 第39页 |
| ·竞争抑制试验 | 第39页 |
| ·WSSV 单抗抑制试验 | 第39页 |
| 2 结果 | 第39-44页 |
| ·病毒提纯 | 第39-40页 |
| ·地高辛标记病毒活性验证 | 第40-41页 |
| ·地高辛标记产量测定 | 第41页 |
| ·对虾细胞原代培养 | 第41页 |
| ·结合现象观察 | 第41-42页 |
| ·两种酶系统比较 | 第42-43页 |
| ·标记病毒梯度结合反应 | 第43页 |
| ·竞争抑制实验 | 第43-44页 |
| ·WSSV 单克隆抗体抑制试验 | 第44页 |
| 3 讨论 | 第44-46页 |
| 第二节 WSSV 主要结构蛋白――VP28 分离及其结合活性验证 | 第46-54页 |
| 1 材料和方法 | 第46-49页 |
| ·材料 | 第46-47页 |
| ·表面活性剂对WSSV 的作用 | 第47页 |
| ·银染分析处理后WSSV 的SDS-PAGE | 第47-48页 |
| ·阳离子交换层析分离增溶的VP 28 | 第48页 |
| ·鳃膜蛋白的提取 | 第48页 |
| ·VP28 结合活性分析 | 第48-49页 |
| 2 结果 | 第49-52页 |
| ·表面活性剂的分离效果 | 第49-50页 |
| ·表面活性剂的最佳增溶浓度 | 第50页 |
| ·VP28 结合活性验证 | 第50-52页 |
| 3 讨论 | 第52-54页 |
| 第三章 对虾组织膜蛋白的制备及其多肽活性 | 第54-80页 |
| 第一节 对虾组织膜蛋白的制备方法及其多肽组成的初步分析 | 第54-61页 |
| 1 材料与方法 | 第55-56页 |
| ·材料 | 第55页 |
| ·膜组份的分离 | 第55-56页 |
| ·SDS-PAGE | 第56页 |
| 2 结果 | 第56-59页 |
| ·膜蛋白 | 第56-57页 |
| ·膜蛋白提取物SDS-PAGE 及其多肽 | 第57-59页 |
| 3 讨论 | 第59-61页 |
| 第二节 对虾鳃细胞膜的层析分离组分结合活性分析 | 第61-69页 |
| 1 材料和方法 | 第61-64页 |
| ·材料 | 第61-62页 |
| ·鳃膜蛋白的提取及DIG 标记 | 第62页 |
| ·表面活性剂对鳃膜蛋白结合活性的影响 | 第62-63页 |
| ·离子交换层析及活性组分样品SDS-PAGE 分析 | 第63页 |
| ·凝胶过滤层析及活性组份样品SDS-PAGE 分析 | 第63-64页 |
| 2 结果 | 第64-67页 |
| ·表面活性剂对虾膜蛋白活性的影响 | 第64-65页 |
| ·离子交换层析得到的对虾鳃膜蛋白活性组份 | 第65-66页 |
| ·凝胶过滤层析得到的对虾鳃膜蛋白活性组份 | 第66-67页 |
| ·分子量约为53 kDa 蛋白是具有与WSSV 结合活性的蛋白 | 第67页 |
| 3 讨论 | 第67-69页 |
| 第三节 对虾细胞膜53kDa 的肽指纹图谱分析 | 第69-74页 |
| 1 材料和方法 | 第69-70页 |
| ·材料 | 第69页 |
| ·SDS-PAGE 分离53kDa 目的蛋白 | 第69-70页 |
| ·质谱分析 | 第70页 |
| 2 结果 | 第70-73页 |
| 3 讨论 | 第73-74页 |
| 第四节 WSSV SDS-PAGE 图谱中常见的43kDa 蛋白的来源分析 | 第74-80页 |
| 1 材料和方法 | 第74-75页 |
| ·材料 | 第74页 |
| ·SDS-PAGE 分离待分析43 kDa 目的蛋白 | 第74-75页 |
| ·分析过程 | 第75页 |
| 2 结果 | 第75-77页 |
| 3 讨论 | 第77-80页 |
| 第四章 4 种白斑综合征病毒(WSSV)蛋白与对虾膜蛋白粘附 | 第80-100页 |
| 第一节 WSSV 粘附蛋白的定位 | 第80-85页 |
| 1 材料和方法 | 第81-83页 |
| ·材料 | 第81页 |
| ·WSSV 病毒粒子的纯化 | 第81-82页 |
| ·地高辛标记对虾血细胞及鳃细胞膜蛋白的制备 | 第82页 |
| ·Western 印迹结合实验 | 第82-83页 |
| 2 结果 | 第83-84页 |
| ·蛋白覆盖印迹结合试验定位WSSV 的4 种粘附蛋白 | 第83-84页 |
| 3 讨论 | 第84-85页 |
| 第二节 WSSV 粘附蛋白VP37 的鉴定分析 | 第85-94页 |
| 1 材料和方法 | 第85-89页 |
| ·材料 | 第85-86页 |
| ·WSSV 的提取 | 第86页 |
| ·VP 37 蛋白洗脱回收 | 第86-87页 |
| ·粗制膜组份的分离及地高辛(DIG) 标记 | 第87页 |
| ·洗脱回收VP 37 结合力验证 | 第87-88页 |
| ·质谱分析 | 第88页 |
| ·VP 37 多抗的制备 | 第88页 |
| ·多抗的特异性检测 | 第88-89页 |
| ·VP 37 多抗与WSSV 高分子量蛋白的交叉反应 | 第89页 |
| 2. 结果 | 第89-93页 |
| ·锌(E-ZincTM)染色 | 第89页 |
| ·洗脱回收VP 37 结合力验证 | 第89-90页 |
| ·质谱分析 | 第90-92页 |
| ·VP 37 多抗的特异性及与WSSV 高分子量蛋白的交叉反应 | 第92-93页 |
| 3 讨论 | 第93-94页 |
| 第三节 VP37 功能小肽人工合成及活性验证 | 第94-100页 |
| 1 材料和方法 | 第94-96页 |
| ·材料 | 第94-95页 |
| ·含有“RGD”位点的VP 37 功能小肽人工合成 | 第95页 |
| ·竞争ELISA 验证VP 37 功能小肽的活性 | 第95页 |
| ·表达VP 37 与VP 37 功能小肽活性比较 | 第95-96页 |
| 2 结果 | 第96-98页 |
| ·VP 37 功能小肽的人工合成 | 第96-97页 |
| ·竞争ELISA 验证VP 37 功能小肽结合活性 | 第97页 |
| ·rVP 37 和其功能小肽结合活性比较 | 第97-98页 |
| 3 讨论 | 第98-100页 |
| 第五章 改造rvp 37 基因的毕赤酵母表达及活性分析 | 第100-126页 |
| 第一节 vp 37 基因改造及人工合成 | 第100-106页 |
| 1. vp37 基因改造 | 第101-104页 |
| ·针对毕赤酵母偏好密码子的vp 37 基因改造 | 第101-102页 |
| ·针对碱基含量的vp 37 基因改造 | 第102-103页 |
| ·vp 37 基因的酶切位点改造 | 第103页 |
| ·mRNA 二级结构分析 | 第103页 |
| ·vp 37 基因的星号活性分析 | 第103页 |
| ·vp 37 基因内含子分析及改造 | 第103-104页 |
| 2. 改造后rvp 37 基因的基本特征验证 | 第104-105页 |
| ·G+C 含量 | 第104页 |
| ·改造前后氨基酸序列验证 | 第104-105页 |
| 3. 讨论 | 第105-106页 |
| 第二节 rvp37 毕赤酵母高表达克隆筛选 | 第106-116页 |
| 1. 材料和方法 | 第106-108页 |
| ·材料 | 第106-107页 |
| ·500μg/mL ZocinTM 高抗性筛选 | 第107页 |
| ·高表达克隆的快速筛选 | 第107-108页 |
| ·高表达克隆的鉴定 | 第108页 |
| 2 结果 | 第108-114页 |
| ·高表达克隆快速筛选 | 第108-109页 |
| ·显色印迹斑分析 | 第109-111页 |
| ·SDS-PAGE 鉴定分析 | 第111-114页 |
| 3 讨论 | 第114-116页 |
| 第三节 表达rVP37 蛋白活性分析及纯化 | 第116-122页 |
| 1. 材料和方法 | 第116-119页 |
| ·材料 | 第116-117页 |
| ·重组VP 37 的摇瓶发酵及硫酸铵沉淀 | 第117-118页 |
| ·ELISA 方法检测重组改造rVP 37 活性 | 第118页 |
| ·Ni2+ 亲和层析纯化重组目的蛋白 | 第118-119页 |
| 2. 结果 | 第119-120页 |
| ·重组目的蛋白活性检测 | 第119页 |
| ·Ni2+亲和层析纯化重组目的蛋白 | 第119-120页 |
| 3. 讨论 | 第120-122页 |
| 第四节 与VP37 相互作用的对虾鳃细胞膜蛋白定位 | 第122-126页 |
| 1. 材料和方法 | 第122-123页 |
| ·材料 | 第122页 |
| ·Ni~(2+) 亲和层析分离WSSV 相互作用的对虾细胞膜蛋白 | 第122-123页 |
| 2. 结果 | 第123-125页 |
| 3. 讨论 | 第125-126页 |
| 结论 | 第126-127页 |
| 本文所使用的仪器设备列表 | 第127-128页 |
| 参考文献 | 第128-136页 |
| 发表文章目录 | 第136-137页 |
| 致谢 | 第137-138页 |
