| 中文摘要 | 第1-6页 |
| 英文摘要 | 第6-15页 |
| 前言 | 第15-48页 |
| 一、 关于有丝分裂染色体集缩的研究 | 第15-19页 |
| 1 组蛋白在染色体集缩中的作用 | 第16-18页 |
| 2 TopoⅡ在染色体集缩中的作用 | 第18-19页 |
| 二、 染色体结构维持蛋白 | 第19-28页 |
| 1 SMC蛋白的发现 | 第20-21页 |
| 2 、 SMC蛋白的结构特点 | 第21-22页 |
| 3 SMC蛋白的分类 | 第22-23页 |
| 4 SMC蛋白的功能 | 第23-26页 |
| 5 原核SMC蛋白 | 第26-28页 |
| 三、 SMC蛋白在染色体集缩中的作用 | 第28-32页 |
| 四、 SMC蛋白在有丝分裂染色体集缩中的可能作用机制 | 第32-37页 |
| 五、 人集缩素的相关研究 | 第37-40页 |
| 六、 RNA干涉技术和基因转导技术以及共转染技术 | 第40-42页 |
| 七、 本研究的目的意义 | 第42-48页 |
| 实验材料 | 第46页 |
| 1 细胞 | 第46页 |
| 2 标准品 | 第46页 |
| 3 培养基和血清 | 第46页 |
| 4 质粒 | 第46页 |
| 5 菌株 | 第46页 |
| 6 工具酶 | 第46页 |
| 7 成套试剂 | 第46-47页 |
| 8 主要仪器 | 第47-48页 |
| 实验方法 | 第48-64页 |
| 一、 HeLa细胞培养 | 第48页 |
| 二、 HeLa细胞总RNA的提取 | 第48-49页 |
| 三、 逆转录(RT，Reverse Transcription)反应 | 第49页 |
| 四、 PCR反应 | 第49-52页 |
| 1 PCR引物 | 第49-51页 |
| (1) 克隆hCAP-E的C-末端序列所用引物 | 第50页 |
| (2) 克隆hCAP-C的C-末端序列所用引物 | 第50页 |
| (3) 附加Kozak序列和附加核定位信号引物 | 第50-51页 |
| (4) 附加Kozak序列和附加核定位信号的GFP引物 | 第51页 |
| (5) 中间克隆载体pUCm-T插入位点上游5′端引物 | 第51页 |
| 2 PCR扩增 | 第51-52页 |
| 五、 从凝胶中纯化回收目的片段 | 第52页 |
| 六、 中间克隆质粒的构建 | 第52-55页 |
| (1) 感受态宿主菌的制备 | 第52-53页 |
| (2) 连接反应 | 第53页 |
| (3) 转化 | 第53页 |
| (4) 重组质粒的鉴定 | 第53-55页 |
| ① 重组质粒小量提取(碱裂解法) | 第53-54页 |
| ② 重组质粒的电泳检测 | 第54页 |
| ③ 重组质粒的纯度与浓度测定 | 第54页 |
| ④ 重组质粒的酶切鉴定 | 第54页 |
| ⑤ 重组质粒方向和PCR鉴定 | 第54-55页 |
| ⑥ 重组质粒DNA序列测定 | 第55页 |
| 七、 真核表达质粒的构建 | 第55-56页 |
| (1) 限制性酶切位点分析 | 第55-56页 |
| (2) 目的片段的制备 | 第56页 |
| (3) 真核表达载体pcDNA3.1(-)的制备 | 第56页 |
| (4) 连接反应 | 第56页 |
| (5) 重组质粒的转化和鉴定 | 第56页 |
| 八、 RNA干涉(RNAi)质粒的构建 | 第56-58页 |
| (一) cDNA编码区的选择 | 第56-57页 |
| (二) 寡核苷酸的设计 | 第57页 |
| (三) 将寡核苷酸片段亚克到pBS／U6载体上 | 第57-58页 |
| 1 寡核苷酸片段的退火 | 第57-58页 |
| 2 载体的准备 | 第58页 |
| 3 连接 | 第58页 |
| 4 重组质粒的转化和鉴定 | 第58页 |
| (四) 将寡核苷酸片段亚克隆到RNAi载体pREP4-PUR上 | 第58页 |
| 九、 重组质粒的大量制备 | 第58-60页 |
| (一) 试剂 | 第58-59页 |
| (二) 操作步骤 | 第59-60页 |
| 十、 Superfect转染程序 | 第60-61页 |
| 十一、 转染后细胞的检测 | 第61-64页 |
| 1 荧光显微镜观察 | 第61页 |
| (1) 用Hoechest33342对转染后活细胞的DNA进行染色标记 | 第61页 |
| (2) 荧光显微镜观察 | 第61页 |
| 2 、 RT-PCR检测 | 第61-64页 |
| (1) 转染后Hela细胞RNA的提取 | 第62页 |
| (2) 逆转录(RT)反应 | 第62-63页 |
| (3) RT-PCR反应 | 第63-64页 |
| 结果与分析 | 第64-96页 |
| 一、 人集缩素SMC亚基hCAP-E和hCAP-C的C-末端真核表达质粒pcDNA 3.1+KNE和pcDNA 3.1+KNC的构建 | 第64-75页 |
| 1 Hela细胞总RNA2％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果 | 第65页 |
| 2 hCAP-E的C末端的真核表达质粒p PcDNA3.1+KNE构建 | 第65-70页 |
| (1) hCAP-E的C末端的RT-PCR扩增 | 第65-66页 |
| (2) 中间克隆质粒T+HEC的构建 | 第66页 |
| (3) 中间克隆质粒T+HEC的DNA序列测定 | 第66-67页 |
| (4) 中间克隆质粒T+ExHCP-1的构建 | 第67-68页 |
| (5) 间克隆质粒T+KNE的构建 | 第68-69页 |
| (6) 中间克隆质粒T+KNE质粒的DNA序列测定 | 第69页 |
| (7) 真核表达质粒pcDNA 3.1+KNE的构建 | 第69-70页 |
| 3 HCAP-C的C末端的真核表达质粒pcDNA 3.1+KNC的构建 | 第70-75页 |
| (1) HCAP-C的C末端的RT-PCR扩增 | 第70-71页 |
| (2) 中间克隆质粒T+HCT-1的构建 | 第71-72页 |
| (3) 中间克隆质粒T+HCT-1的序列测定 | 第72-73页 |
| (4) 中间克隆质粒T+KNC的构建 | 第73页 |
| (5) 真核表达质粒pcDNA 3.1+KNC的构建 | 第73-74页 |
| (6) 真核表达质粒pcDNA 3.1+KNC的序列测定 | 第74-75页 |
| 二、 附加Kozac序列和核定位信号的GFP真核表达质粒pcDNA 3.1+KG的构建 | 第75-78页 |
| 1 中间克隆质粒T+KG的构建 | 第76页 |
| 2 真核表达质粒pcDNA 3.1+KG的构建 | 第76-77页 |
| 3 真核表达质粒pcDNA 3.1+KG的序列测定 | 第77-78页 |
| 三、 人集缩素SMC亚基hCAP-E和hCAP-C特异的RNAi质粒的构建 | 第78-80页 |
| (一) cDNA编码区的选择 | 第79页 |
| (二) 寡核苷酸的设计 | 第79页 |
| (三) 目的RNAi质粒的鉴定 | 第79-80页 |
| 四、 真核细胞转染体系的建立 | 第80-82页 |
| 1 重组质粒的大量制备 | 第80-81页 |
| 2 核定位信号的有效性 | 第81-82页 |
| 3 转染真核表达质粒pcDNA3.1+KG的细胞形态 | 第82页 |
| 五、 转染人集缩素SMC亚基hCAP-E和hCAP-CC-末端的作用分析 | 第82-88页 |
| 1 转染人集缩素SMC亚基hCAP-E的C-末端真核表达质粒pcDNA3.1+KNE导致Hela细胞表现多核和染色质桥现象 | 第83-86页 |
| (1) 转染后细胞的形态变化 | 第83-84页 |
| (2) 转染后Hela细胞的RT-PCR检测 | 第84-86页 |
| 2 转染人集缩素SMC亚基hCAP-C的C-末端真核表达质粒pcDNA3.1+KNC导致细胞表现有丝分裂染色体不分开现象 | 第86-88页 |
| (1) 转染后细胞的形态变化 | 第86-87页 |
| (2) 转染后细胞的RT-PCR检测 | 第87-88页 |
| 六、 转染人集缩素SMC亚基hCAP-E和hCAP-C特异的RNAi质粒RHE和RHC导致Hela细胞表现有丝分裂染色体不分开现象 | 第88-96页 |
| 1 人集缩素SMC亚基hCAP-E特异的RNAi质粒RHE导致Hela细胞表现有丝分裂染色体不分开现象 | 第88-91页 |
| (1) 转染后细胞的形态变化 | 第88-90页 |
| (2) 转染后细胞的RT-PCR检测 | 第90-91页 |
| 2 转染人集缩素SMC亚基hCAP-C特异的RNAi质粒RHC导致Hela细胞表现有丝分裂染色不分开现象 | 第91-94页 |
| (1) 转染后细胞的形态变化 | 第91-93页 |
| (2) 转染后细胞的RT-PCR检测 | 第93-94页 |
| 3 共转染人集缩素SMC亚基hCAP-E和hCAP-C特异的RNAi质粒RHE和RHC和pcDNA3.1+KG导致Hela细胞表现染色质桥现象 | 第94-96页 |
| 讨论 | 第96-104页 |
| 一、 RNAi下调人集缩素SMC亚基hCAP-E和hCAP-C表达的结果分析 | 第96-98页 |
| 二、 转染人集缩素SMC亚基hCAP-E和hCAP-CC-末端的作用分析 | 第98-100页 |
| 三、 研究基因功能的共转染体系的建立 | 第100-102页 |
| 四、 人集缩素SMC亚基C-末端真核表达构建的策略 | 第102-104页 |
| 结论 | 第104-105页 |
| 本论文的主要的创新点 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-123页 |
| 致谢 | 第123-124页 |
| 作者简历 | 第124页 |
