| 致谢 | 第1-10页 |
| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-15页 |
| 第一章 前言 | 第15-42页 |
| 1 肌酐检测方法 | 第15-19页 |
| ·化学方法 | 第15-16页 |
| ·酶促方法 | 第16-18页 |
| ·肌酐转化为甲基乙内酰脲和NH4的酶促方法 | 第17页 |
| ·肌酐转化为肌酸-以NADH为指示剂的酶促方法 | 第17-18页 |
| ·降解肌酐为肌酸、肌氨酸、甘氨酸的酶促方法 | 第18页 |
| ·电气化学方法 | 第18-19页 |
| 2 肌酐水解酶的研究概况 | 第19-23页 |
| ·产肌酐水解酶的微生物 | 第19-20页 |
| ·肌酐水解酶的酶学性质 | 第20-22页 |
| ·肌酐水解酶的分子生物学研究 | 第22页 |
| ·肌酐水解酶结构与功能的研究 | 第22-23页 |
| 3 肌酸水解酶的研究概况 | 第23-26页 |
| ·肌酸水解酶的分布 | 第23页 |
| ·肌酸水解酶的酶学性质 | 第23-24页 |
| ·肌酸水解酶的分子生物学研究现状 | 第24-25页 |
| ·肌酸水解酶结构与功能研究 | 第25-26页 |
| 4 肌氨酸氧化酶的研究概况 | 第26-31页 |
| ·肌氨酸氧化酶的分布 | 第26页 |
| ·肌氨酸氧化酶的酶学性质 | 第26-28页 |
| ·单聚体肌氨酸氧化酶 | 第26-27页 |
| ·多聚体肌氨酸氧化酶 | 第27-28页 |
| ·肌氨酸氧化酶的分子生物学研究 | 第28-29页 |
| ·肌氨酸氧化酶的结构与功能研究 | 第29-31页 |
| 5 蛋白质工程 | 第31-40页 |
| ·理性设计 | 第31-32页 |
| ·定向进化 | 第32-36页 |
| ·随机突变 | 第33页 |
| ·重组技术 | 第33-35页 |
| ·区域性选择突变 | 第35-36页 |
| ·突变库的筛选 | 第36-39页 |
| ·表型观察选择和筛选 | 第36-37页 |
| ·96孔板筛选 | 第37页 |
| ·噬菌体表面展示技术 | 第37-38页 |
| ·核糖体展示技术 | 第38页 |
| ·细菌表面展示技术 | 第38-39页 |
| ·定向进化应用 | 第39-40页 |
| 6 选题背景及研究内容 | 第40-42页 |
| 第二章 芽孢杆菌Bacillus sp.BSD-8肌氨酸氧化酶基因的克隆、测序与表达 | 第42-61页 |
| 1 材料 | 第42-44页 |
| ·菌株、载体和酶 | 第42页 |
| ·培养基 | 第42-43页 |
| ·缓冲液配制 | 第43-44页 |
| ·主要仪器和设备 | 第44页 |
| 2 方法 | 第44-53页 |
| ·Bacillus sp.BSD-8肌氨酸氧化酶基因的克隆、测序 | 第44-47页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第44页 |
| ·染色体步移PCR | 第44-46页 |
| ·染色体步移PCR具体步骤 | 第46-47页 |
| ·序列测定与分析 | 第47页 |
| ·Bacillus sp.BSD-8肌氨酸氧化酶基因的扩增 | 第47页 |
| ·重组载体的构建 | 第47-50页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第50-51页 |
| ·转化子的挑选及鉴定 | 第51-52页 |
| ·工程菌的诱导表达 | 第52页 |
| ·肌氨酸氧化酶的测定方法 | 第52页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第52-53页 |
| 3 结果与分析 | 第53-60页 |
| ·Bacillus sp.BSD-8 SOX基因的扩增 | 第53-57页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第57-59页 |
| ·重组载体的表达 | 第59-60页 |
| 4 结论 | 第60-61页 |
| 第三章 重组肌氨酸氧化酶的纯化及其性质研究 | 第61-71页 |
| 1 材料 | 第61-62页 |
| ·材料及试剂 | 第61页 |
| ·培养基及缓冲液 | 第61页 |
| ·主要仪器 | 第61-62页 |
| 2 方法 | 第62-64页 |
| ·菌体的大量培养 | 第62页 |
| ·肌氨酸氧化酶的测定方法 | 第62页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第62页 |
| ·重组酶的纯化 | 第62-63页 |
| ·重组肌氨酸氧化酶性质的研究 | 第63-64页 |
| ·SOX与黄素的结合方式的研究 | 第64页 |
| 3 结果 | 第64-67页 |
| ·肌氨酸氧化酶的纯化结果 | 第64-65页 |
| ·SOX的最适作用温度与热稳定性 | 第65-66页 |
| ·SOX的最适作用pH与pH稳定性 | 第66页 |
| ·酶促反应动力学研究 | 第66-67页 |
| ·SOX与黄素的结合 | 第67页 |
| 4 讨论 | 第67-70页 |
| 5 结论 | 第70-71页 |
| 第四章 肌氨酸氧化酶的定向进化 | 第71-84页 |
| 1 材料 | 第71-72页 |
| ·菌株、载体和酶 | 第71页 |
| ·主要仪器和设备 | 第71-72页 |
| 2.方法 | 第72-76页 |
| ·质粒的提取 | 第72页 |
| ·易错PCR扩增肌氨酸氧化酶基因 | 第72-73页 |
| ·突变库的构建 | 第73页 |
| ·突变文库的筛选 | 第73-74页 |
| ·定点突变 | 第74-75页 |
| ·构建pET-soxM2和BL21(DE3)表达系统 | 第75页 |
| ·突变酶的热稳定性 | 第75-76页 |
| 3.结果与分析 | 第76-81页 |
| ·肌氨酸氧化酶体外定向进化设计 | 第76-77页 |
| ·易错PCR建立突变文库 | 第77-79页 |
| ·定点突变 | 第79-80页 |
| ·构建pET-soxM2表达载体 | 第80页 |
| ·突变酶soxM2的热稳定性 | 第80-81页 |
| ·热稳定性突变酶的耐热机制分析 | 第81页 |
| 4 讨论 | 第81-83页 |
| 5 结论 | 第83-84页 |
| 第五章 肌酸水解酶基因的克隆、表达与酶性质研究 | 第84-98页 |
| 1 材料 | 第84-85页 |
| ·菌种和载体 | 第84页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第84页 |
| ·常用仪器 | 第84-85页 |
| 2 实验方法 | 第85-88页 |
| ·Bacillus sp.BSD-8基因组DNA的提取 | 第85页 |
| ·Bacillus sp.BSD-8肌酸水解酶基因的克隆和测序 | 第85-87页 |
| ·构建重组载体pET-28a-CRE | 第87-88页 |
| ·工程菌的诱导表达 | 第88页 |
| ·重组酶的纯化 | 第88页 |
| ·肌酸水解酶的酶活测定 | 第88页 |
| 3 结果与分析 | 第88-95页 |
| ·Bacillus sp.BSD-8 CRE基因的扩增 | 第88-93页 |
| ·重组表达载体pET-28a-CRE的构建 | 第93页 |
| ·重组表达载体pET-28a-CRE的诱导表达 | 第93-94页 |
| ·肌酸水解酶的纯化结果 | 第94-95页 |
| 4 讨论 | 第95-97页 |
| 5 结论 | 第97-98页 |
| 第六章 肌酐水解酶基因的克隆、测序 | 第98-105页 |
| 1 材料 | 第98-99页 |
| ·菌株、载体和酶 | 第98页 |
| ·常用培养基 | 第98页 |
| ·主要仪器和设备 | 第98-99页 |
| 2 试验方法 | 第99-102页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第99页 |
| ·Bacillus sp.BSD-8肌酐水解酶基因片段的扩增 | 第99页 |
| ·Bacillus sp.BSD-8肌酐水解酶基因侧翼序列的扩增 | 第99-101页 |
| ·序列测定与分析 | 第101-102页 |
| 3 结果与分析 | 第102-104页 |
| ·Bacillus sp.BSD-8肌酐水解酶基因片段的扩增 | 第102-103页 |
| ·Bacillus sp.BSD-8肌酐水解酶基因侧翼序列的扩增 | 第103-104页 |
| 4 结论 | 第104-105页 |
| 第七章 结论与展望 | 第105-107页 |
| 1 结论 | 第105-106页 |
| ·Bacillus sp.BSD-8肌氨酸氧化酶基因的克隆、测序与表达 | 第105页 |
| ·肌氨酸氧化酶的纯化与酶性质的研究 | 第105页 |
| ·热稳定性肌氨酸氧化酶的定向进化 | 第105-106页 |
| ·肌酸水解酶基因的克隆、高效表达及酶性质的研究 | 第106页 |
| ·肌酐水解酶基因的克隆、测序 | 第106页 |
| 2 展望 | 第106-107页 |
| REFERENCES | 第107-116页 |
| 作者简介 | 第116-117页 |
