| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 目录 | 第11-17页 |
| 第一部分 文献综述 | 第17-41页 |
| 一、野生哺乳动物贝蛔虫病研究进展 | 第17-26页 |
| 1 贝蛔虫的分类地位与种类 | 第17页 |
| 2 野生哺乳动物的主要贝蛔虫病 | 第17-26页 |
| ·浣熊贝蛔虫病 | 第18-20页 |
| ·病原形态 | 第18页 |
| ·生物学与流行病学 | 第18-19页 |
| ·致病作用、病理变化与临床症状 | 第19-20页 |
| ·诊断与防治 | 第20页 |
| ·转移贝蛔虫病 | 第20-22页 |
| ·病原形态 | 第20页 |
| ·生物学与流行病学 | 第20-21页 |
| ·致病作用与临床症状 | 第21-22页 |
| ·诊断与防治 | 第22页 |
| ·西氏贝蛔虫病 | 第22-26页 |
| ·病原形态 | 第22-23页 |
| ·生物学与流行病学 | 第23-25页 |
| ·致病作用与临床症状 | 第25-26页 |
| ·诊断与防治 | 第26页 |
| 3 存在的问题与展望 | 第26页 |
| 二、分子系统发生学及其在线虫研究中的应用 | 第26-39页 |
| 1 分子系统发生的概念及发展史 | 第26-28页 |
| 2 分子系统发生学的常用方法 | 第28-30页 |
| ·序列信息检验 | 第28页 |
| ·分类群的选择 | 第28页 |
| ·系统树的构建 | 第28-30页 |
| 3 分子系统发生学的特点 | 第30页 |
| 4 线虫分子系统发生分析常用靶序列 | 第30-39页 |
| ·核糖体内部转录间隔区(ITS) | 第31-34页 |
| ·核糖体内部转录间隔区(ITS)的特点 | 第31-32页 |
| ·转录间隔区(ITS)在线虫分类的应用 | 第32-34页 |
| ·线粒体(mtDNA)基因 | 第34-39页 |
| ·线粒体(mtDNA)基因的特点 | 第34-35页 |
| ·研究线粒体基因的重要意义 | 第35页 |
| ·线粒体(mtDNA)基因在线虫研究中的应用 | 第35-39页 |
| 5 结语 | 第39页 |
| 三、本研究的目的和意义 | 第39-41页 |
| 第二部分 研究内容 | 第41-133页 |
| 第一章 大熊猫等八种野生哺乳动物蛔虫核糖体第二内部转录间隔区(ITS-2)基因的序列分析 | 第41-53页 |
| 1 材料与试剂 | 第42-43页 |
| ·主要试剂的配制 | 第42页 |
| ·PCR相关试剂 | 第42页 |
| ·其它实验室常规试剂 | 第42-43页 |
| ·样品 | 第43页 |
| 2 方法 | 第43-46页 |
| ·虫体总DNA的提取 | 第43-44页 |
| ·蛔虫ITS-2基因PCR扩增和测序 | 第44页 |
| ·PCR扩增产物的回收及测序 | 第44-45页 |
| ·数据分析与处理 | 第45-46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-49页 |
| ·PCR扩增产物 | 第46-47页 |
| ·大熊猫、小熊猫等8种野生动物寄生蛔虫ITS-2基因序列变异及碱基组成 | 第47-48页 |
| ·大熊猫、等8种野生动物寄生蛔虫的ITS-2基因序列相似性和分歧度 | 第48页 |
| ·基于蛔虫ITS-2基因构建的分子系统树 | 第48-49页 |
| 4 讨论 | 第49-52页 |
| 5 小结 | 第52-53页 |
| 第二章 基于ND1基因序列分析大熊猫等8种野生哺乳动物寄生蛔虫的系统进化关系 | 第53-65页 |
| 1 材料与方法 | 第54-56页 |
| ·材料与试剂 | 第54页 |
| ·方法 | 第54-56页 |
| ·蛔虫DNA的提取 | 第54页 |
| ·模板DNA的质量检测与浓度确定 | 第54页 |
| ·PCR扩增与序列测定 | 第54页 |
| ·DNA序列的数据处理 | 第54-56页 |
| 2 结果与分析 | 第56-61页 |
| ·PCR扩增产物 | 第56页 |
| ·大熊猫等8种野生动物蛔虫ND1部分序列的碱基组成、相似性和分歧度 | 第56-58页 |
| ·基于ND1基因部分序列构建分子系统树的构建 | 第58-61页 |
| 3 讨论 | 第61-63页 |
| 4 小结 | 第63-65页 |
| 第三章 西氏贝蛔虫Bs-Ag1基因的序列分析及重组蛋白诱导小鼠的免疫保护研究 | 第65-87页 |
| 1 材料与试剂 | 第66-68页 |
| ·实验动物 | 第66页 |
| ·大熊猫西氏贝蛔虫 | 第66页 |
| ·主要试剂 | 第66页 |
| ·菌株和质粒 | 第66页 |
| ·常用缓冲溶液和培养基的配制 | 第66-67页 |
| ·主要仪器设备 | 第67页 |
| ·主要生物信息数据库和计算机软件 | 第67-68页 |
| 2 方法 | 第68-76页 |
| ·西氏贝蛔虫感染性虫卵的培养 | 第68页 |
| ·兔抗西氏贝蛔虫阳性血清的制备 | 第68页 |
| ·西氏贝蛔虫成虫和二期幼虫总RNA的提取 | 第68页 |
| ·第一链cDNA的合成 | 第68-69页 |
| ·Bs-Ag1基因的扩增和克隆 | 第69页 |
| ·PCR产物的回收 | 第69页 |
| ·Bs-Ag1基因克隆、鉴定及转化 | 第69-70页 |
| ·Bs-Ag1基因序列分析 | 第70页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第70-72页 |
| ·Bs-Ag1基因片段扩增 | 第70-71页 |
| ·质粒DNA的小量提取 | 第71页 |
| ·pMD18-T-Bs-Ag1重组质粒的酶切 | 第71页 |
| ·连接 | 第71-72页 |
| ·pET32a(+)-Bs-Ag1重组质粒的酶切鉴定 | 第72页 |
| ·测序鉴定 | 第72页 |
| ·重组pET32a(+)-Bs-Ag1质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第72页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第72-73页 |
| ·rBs-Ag1包涵体表达条件的优化 | 第73页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第73-74页 |
| ·Western-blot分析 | 第74页 |
| ·小鼠免疫保护试验 | 第74-75页 |
| ·最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确 | 第75页 |
| ·临界值的确定 | 第75页 |
| ·ELISA检测小鼠血清抗rBs-Ag1蛋白的特异性IgG抗体水平 | 第75页 |
| ·数据统计 | 第75-76页 |
| 3 结果 | 第76-84页 |
| ·RT-PCR | 第76页 |
| ·基因克隆菌落PCR鉴定 | 第76页 |
| ·西氏贝蛔虫Bs-Ag1基因的序列分析 | 第76-78页 |
| ·重组pMD18-T-Bs-Ag1质粒酶切鉴定 | 第78-79页 |
| ·重组pET32a(+)-Bs-Ag1质粒的酶切鉴定 | 第79页 |
| ·重组蛋白的表达和SDS-PAGE分析 | 第79-80页 |
| ·IPTG浓度的优化 | 第80页 |
| ·诱导时间的优化 | 第80-81页 |
| ·Western-blot分析 | 第81页 |
| ·幼虫的分离 | 第81-82页 |
| ·包被抗原和抗体最佳工作浓度测定 | 第82-83页 |
| ·临界值的确定 | 第83页 |
| ·鼠血清样本IgG的ELISA检测 | 第83-84页 |
| 4 分析与讨论 | 第84-86页 |
| 5 小结 | 第86-87页 |
| 第四章 西氏贝蛔虫Bs-Ag2抗原基因的克隆、原核表达及重组表达蛋白的免疫保护研究 | 第87-103页 |
| 1 材料与试剂 | 第87页 |
| 2 方法 | 第87-90页 |
| ·西氏贝蛔虫感染性虫卵的培养和兔抗西氏贝蛔虫阳性血清制备 | 第87-88页 |
| ·西氏贝蛔虫总RNA的提取 | 第88页 |
| ·Bs-Ag2基因RT-PCR扩增和克隆 | 第88页 |
| ·Bs-Ag2基因克隆及鉴定 | 第88页 |
| ·Bs-Ag2基因序列分析 | 第88页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第88-90页 |
| ·Bs-Ag2基因片段的扩增与鉴定 | 第89页 |
| ·质粒DNA的小量提取 | 第89页 |
| ·重组pMD18-Bs-Ag2质粒的酶切质粒的鉴定 | 第89页 |
| ·测序鉴定 | 第89页 |
| ·连接 | 第89-90页 |
| ·重组质粒pET32a(+)-Bs-Ag2的酶切鉴定 | 第90页 |
| ·测序鉴定 | 第90页 |
| ·重组pET32a(+)-Bs-Ag2质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第90页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第90页 |
| ·重组rBs-Ag2包涵体表达条件的优化 | 第90页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第90页 |
| ·表达产物的Western-blot分析 | 第90页 |
| ·小鼠免疫保护试验 | 第90页 |
| ·最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定 | 第90页 |
| ·临界值的确定 | 第90页 |
| ·ELISA检测小鼠血清抗rBs-Ag2蛋白的特异性IgG抗体水平 | 第90页 |
| ·数据处理 | 第90页 |
| 3 结果 | 第90-99页 |
| ·大熊猫蛔虫Bs-Ag2基因的RT-PCR扩增 | 第91页 |
| ·Bs-Ag2基因克隆鉴定及序列分析 | 第91-93页 |
| ·重组pMD18-T-Bs-Ag2质粒酶切鉴定 | 第93-94页 |
| ·Bs-Ag2基因片段重组表达载体pET32a(+)的筛选与鉴定 | 第94页 |
| ·pET32a(+)-Bs-Ag2在BL21(DE3)中的表达 | 第94-95页 |
| ·IPTG浓度的优化 | 第95页 |
| ·诱导时间的优化 | 第95-96页 |
| ·Western-blot分析 | 第96页 |
| ·免疫保护试验结果 | 第96-97页 |
| ·包被抗原和抗体最佳工作浓度测定 | 第97-98页 |
| ·临界值的确定 | 第98页 |
| ·鼠血清样本IgG的ELISA检测 | 第98-99页 |
| 4 分析与讨论 | 第99-101页 |
| 5 小结 | 第101-103页 |
| 第五章 似蚓蛔虫Al-Ag1抗原基因的克隆、原核表达及重组表达蛋白的免疫保护研究 | 第103-119页 |
| 1 材料与方法 | 第103-107页 |
| ·材料与试剂 | 第103-104页 |
| ·似蚓蛔虫感染性虫卵的培养 | 第104页 |
| ·兔抗似蚓蛔虫阳性血清的制备 | 第104页 |
| ·似蚓蛔虫总RNA的提取 | 第104页 |
| ·RT-PCR法扩增A1-Ag1基因 | 第104页 |
| ·Al-Ag1基因的扩增 | 第104页 |
| ·Al-Ag1基因序列分析 | 第104页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第104-106页 |
| ·Al-Ag1基因片段扩增 | 第105页 |
| ·质粒DNA的小量提取 | 第105页 |
| ·重组pMD18-Al-Ag1质粒的酶切鉴定 | 第105页 |
| ·测序鉴定 | 第105页 |
| ·连接 | 第105页 |
| ·重组质粒pET32a(+)-Al-Ag1的酶切鉴定 | 第105-106页 |
| ·测序鉴定 | 第106页 |
| ·重组pET32a(+)-Al-Ag1质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第106页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第106页 |
| ·重组Al-Ag1包涵体表达条件的优化 | 第106页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第106页 |
| ·表达产物的Western-blot分析 | 第106页 |
| ·小鼠免疫保护试验 | 第106页 |
| ·最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定 | 第106-107页 |
| ·临界值的确定 | 第107页 |
| ·ELISA检测小鼠血清抗rBs-Ag2蛋白的特异性IgG抗体水平 | 第107页 |
| ·数据处理 | 第107页 |
| 2 结果 | 第107-115页 |
| ·似蚓蛔虫Al-Ag1基因的PCR扩增 | 第107页 |
| ·似蚓蛔虫Al-Ag1基因克隆和序列分析 | 第107-109页 |
| ·重组表达载体pMD18-T-Al-Ag1的筛选与鉴定 | 第109-110页 |
| ·重组表达载体pET32a(+)-Al-Ag1的筛选与鉴定 | 第110页 |
| ·pET32a(+)-Al-Ag1在BL21(DE3)中的表达 | 第110-111页 |
| ·IPTG浓度的优化 | 第111页 |
| ·诱导时间的优化 | 第111-112页 |
| ·Western-blot分析 | 第112页 |
| ·幼虫的分离 | 第112-113页 |
| ·包被抗原和抗体最佳工作浓度测定 | 第113-114页 |
| ·临界值的确定 | 第114页 |
| ·鼠血清样本IgG的ELISA检测 | 第114-115页 |
| 3 讨论与分析 | 第115-117页 |
| 4 小结 | 第117-119页 |
| 第六章 似蚓蛔虫Al-Ag2抗原基因的克隆、原核表达及重组表达蛋白的免疫保护研究 | 第119-133页 |
| 1 材料与试剂 | 第119页 |
| 2 方法 | 第119-122页 |
| ·似蚓蛔虫感染性虫卵的培养 | 第119页 |
| ·兔抗似蚓蛔虫阳性血清的制备 | 第119-120页 |
| ·似蚓蛔虫总RNA的提取 | 第120页 |
| ·RT-PCR法扩增Al-Ag2基因 | 第120页 |
| ·Al-Ag2基因的扩增 | 第120页 |
| ·Al-Ag2基因序列分析 | 第120页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第120-121页 |
| ·Al-Ag2基因片段扩增 | 第120-121页 |
| ·质粒DNA的小量提取 | 第121页 |
| ·重组pMD18-Al-Ag2质粒的酶切质粒的鉴定 | 第121页 |
| ·测序鉴定 | 第121页 |
| ·连接 | 第121页 |
| ·重组质粒pET32a(+)-Al-Ag2的酶切鉴定 | 第121页 |
| ·测序鉴定 | 第121页 |
| ·重组pET32a(+)-Al-Ag2质粒在大肠杆菌中的诱导表达 | 第121页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第121页 |
| ·重组Al-Ag2包涵体表达条件的优化 | 第121页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第121页 |
| ·表达产物的Western-blot分析 | 第121-122页 |
| ·小鼠免疫保护试验 | 第122页 |
| ·最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定 | 第122页 |
| ·临界值的确定 | 第122页 |
| ·ELISA检测小鼠血清抗rBs-Ag2蛋白的特异性IgG抗体水平 | 第122页 |
| ·数据处理 | 第122页 |
| 3 结果 | 第122-130页 |
| ·似蚓蛔虫Al-Ag2基因的RT-PCR扩增 | 第122页 |
| ·似蚓蛔虫Al-Ag2基因克隆和序列分析 | 第122-124页 |
| ·重组表达载体pMD18-T-Al-Ag2的筛选与鉴定 | 第124-125页 |
| ·重组表达载体pET32a(+)-Al-Ag2的筛选与鉴定 | 第125页 |
| ·pET32a(+)-Al-Ag2在E.coliBL21中的表达 | 第125-127页 |
| ·IPTG浓度的优化 | 第126页 |
| ·诱导时间的优化 | 第126-127页 |
| ·Western-blot分析 | 第127页 |
| ·免疫保护试验结果 | 第127-128页 |
| ·包被抗原和抗体最佳工作浓度测定 | 第128-129页 |
| ·临界值的确定 | 第129页 |
| ·鼠血清样本IgG的ELISA检测 | 第129-130页 |
| 4 分析与讨论 | 第130-132页 |
| 5 小结 | 第132-133页 |
| 第三部分 结论 | 第133-135页 |
| 参考文献 | 第135-148页 |
| 致谢 | 第148-149页 |
| 附录 | 第149-151页 |
| 攻读博士学位期间论文发表 | 第151页 |
