| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第1章 文献综述 | 第14-36页 |
| 1.1 杀鱼爱德华氏菌 | 第14-18页 |
| 1.1.1 杀鱼爱德华氏菌概述 | 第14-15页 |
| 1.1.2 杀鱼爱德华氏菌的主要毒力系统 | 第15-18页 |
| 1.1.3 杀鱼爱德华氏菌T3/T6SS毒力调控网络 | 第18页 |
| 1.2 代谢和毒力表达相互作用关系 | 第18-20页 |
| 1.2.1 糖代谢和毒力关系 | 第18-19页 |
| 1.2.2 脂肪酸代谢和毒力关系 | 第19-20页 |
| 1.3 脂肪酸代谢 | 第20-26页 |
| 1.3.1 细菌的脂肪酸代谢系统 | 第20-24页 |
| 1.3.2 真核生物体内脂肪酸代谢 | 第24-26页 |
| 1.4 脂滴与病原菌相互作用 | 第26-30页 |
| 1.4.1 脂滴 | 第26-27页 |
| 1.4.2 真核生物体内脂滴相关蛋白 | 第27-29页 |
| 1.4.3 脂滴和免疫 | 第29页 |
| 1.4.4 病原微生物利用宿主体内的脂滴完成定植 | 第29-30页 |
| 1.5 转座子插入突变文库 | 第30-35页 |
| 1.5.1 转座子功能和分类 | 第30-32页 |
| 1.5.2 位点确定转座子插入突变文库 | 第32-33页 |
| 1.5.3 转座子插入测序 | 第33-35页 |
| 1.6 本课题的研究内容及意义 | 第35-36页 |
| 第2章 转座子插入突变文库的构建 | 第36-51页 |
| 2.1 前言 | 第36页 |
| 2.2 实验材料 | 第36-38页 |
| 2.2.1 菌种和质粒 | 第36页 |
| 2.2.2 主要试剂及缓冲液的配制 | 第36-38页 |
| 2.2.3 分析处理软件 | 第38页 |
| 2.3 实验方法 | 第38-40页 |
| 2.3.1 大肠杆菌感受态细胞制备 | 第38-39页 |
| 2.3.2 接合 | 第39页 |
| 2.3.3 突变株挑选和平板克隆 | 第39页 |
| 2.3.4 热不对称PCR | 第39-40页 |
| 2.3.5 测序数据处理 | 第40页 |
| 2.4 实验结果 | 第40-47页 |
| 2.4.1 转座子插入位点确定的突变株文库的构建 | 第40-43页 |
| 2.4.2 转座子插入位点确定的突变株文库数据统计分析 | 第43-47页 |
| 2.4.3 转座子插入位点的验证和子库构建 | 第47页 |
| 2.5 讨论 | 第47-50页 |
| 2.6 本章小结 | 第50-51页 |
| 第3章 三型分泌系统调控因子筛选和鉴定 | 第51-73页 |
| 3.1 前言 | 第51页 |
| 3.2 实验材料 | 第51-53页 |
| 3.3 实验方法 | 第53-56页 |
| 3.3.1 文库的筛选 | 第54页 |
| 3.3.2 沉降表型 | 第54页 |
| 3.3.3 缺失株构建 | 第54-55页 |
| 3.3.4 胞外蛋白抽提 | 第55页 |
| 3.3.5 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第55页 |
| 3.3.6 生长曲线和荧光素酶的测定 | 第55页 |
| 3.3.7 Western blot | 第55-56页 |
| 3.3.8 凝胶迁移阻滞实验 | 第56页 |
| 3.4 实验结果 | 第56-71页 |
| 3.4.1 文库筛选结果分析 | 第56-59页 |
| 3.4.2 T3SS基因岛外蛋白对T3SS的显著激活 | 第59页 |
| 3.4.3 转座子插入突变株和框内缺失株表型对比 | 第59页 |
| 3.4.4 ETAE_1437 (YebC)的功能分析 | 第59-62页 |
| 3.4.5 ETAE_2071 (EvrA)的功能分析 | 第62-67页 |
| 3.4.6 EvrA结合Mannose-6P增强对T3/T6SS的激活 | 第67-71页 |
| 3.5 讨论 | 第71-72页 |
| 3.6 本章小结 | 第72-73页 |
| 第4章 大菱鲆体内毒力相关基因筛选 | 第73-83页 |
| 4.1 前言 | 第73页 |
| 4.2 实验材料 | 第73-75页 |
| 4.3 实验方法 | 第75-77页 |
| 4.3.1 杀鱼爱德华氏菌在大菱鲆体内筛选 | 第75页 |
| 4.3.2 高通量测序文库构建 | 第75-76页 |
| 4.3.3 测序结果分析 | 第76页 |
| 4.3.4 大菱鲆的驯养和攻毒 | 第76-77页 |
| 4.4 实验结果 | 第77-80页 |
| 4.4.1 大菱鲆感染模型和突变株文库体内筛选 | 第77-78页 |
| 4.4.2 杀鱼爱德华氏菌感染大菱鲆过程必需基因分析 | 第78页 |
| 4.4.3 脂肪酸代谢相关基因体内毒力验证 | 第78-80页 |
| 4.5 讨论 | 第80-82页 |
| 4.6 本章小结 | 第82-83页 |
| 第5章 胞内长链不饱和脂肪酸对T3SS表达的调控 | 第83-101页 |
| 5.1 前言 | 第83页 |
| 5.2 实验材料 | 第83-86页 |
| 5.3 实验方法 | 第86-88页 |
| 5.3.1 荧光素酶(luxAB)和EGFP表达质粒构建 | 第86页 |
| 5.3.2 EsrC及点突变蛋白表达纯化 | 第86-87页 |
| 5.3.3 脂肪酸组成测定 | 第87-88页 |
| 5.3.4 细胞培养和细胞感染 | 第88页 |
| 5.3.5 普通荧光细胞样品处理 | 第88页 |
| 5.4 实验结果 | 第88-99页 |
| 5.4.1 脂肪酸代谢相关基因影响T3SS表达 | 第88-92页 |
| 5.4.2 脂肪酸组成影响T3SS表达 | 第92-94页 |
| 5.4.3 长链不饱和脂肪酸通过结合EsrC抑制T3SS表达 | 第94-97页 |
| 5.4.4 EsrC通过EsrC~(R38)直接结合UFA | 第97-99页 |
| 5.5 讨论 | 第99-100页 |
| 5.6 本章小结 | 第100-101页 |
| 第6章 T3SS操控宿主体内脂肪酸组成促进病原菌在宿主体内定植 | 第101-121页 |
| 6.1 前言 | 第101页 |
| 6.2 实验材料 | 第101-103页 |
| 6.3 实验方法 | 第103-107页 |
| 6.3.1 表达质粒和病毒转染质粒构建 | 第103页 |
| 6.3.2 HeLa和J774A.1细胞感染 | 第103-104页 |
| 6.3.3 乳糖脱氢酶检测 | 第104页 |
| 6.3.4 慢病毒制备和转染 | 第104页 |
| 6.3.5 CRISPR/Cas9敲除细胞株筛选 | 第104-105页 |
| 6.3.6 脂滴、Plin2和HA融合蛋白免疫荧光检测 | 第105页 |
| 6.3.7 免疫透射电镜样品制备 | 第105-106页 |
| 6.3.8 蛋白质免疫共沉淀 | 第106页 |
| 6.3.9 斑马鱼活体成像和攻毒实验 | 第106-107页 |
| 6.4 实验结果 | 第107-117页 |
| 6.4.1 HeLa细胞中LD含量与UFA含量线性相关 | 第107页 |
| 6.4.2 T3SS通过NF-κB信号通路激活SCD1表达 | 第107-111页 |
| 6.4.3 E.piscicida ΔT3SS感染激活宿主细胞的UFA和LD合成 | 第111-113页 |
| 6.4.4 E.piscicida招募LD进入囊泡 | 第113-115页 |
| 6.4.5 UFA抑制E.piscicida在HeLa细胞中定植 | 第115-117页 |
| 6.4.6 UFA/LD有助于宿主抵抗E.piscicida感染 | 第117页 |
| 6.5 讨论 | 第117-119页 |
| 6.6 本章小结 | 第119-121页 |
| 第7章 结论与展望 | 第121-124页 |
| 7.1 主要结论 | 第121页 |
| 7.2 论文创新点 | 第121-122页 |
| 7.3 展望 | 第122-124页 |
| 参考文献 | 第124-136页 |
| 致谢 | 第136-137页 |
| 攻读博士学位期间的论文成果 | 第137-138页 |
| 附录一 | 第138-139页 |
| 附录二 | 第139-140页 |
