| 摘要 | 第11-13页 |
| ABSTRACT | 第13-15页 |
| 符号和缩略语说明 | 第16-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-33页 |
| 第一节 碳代谢途径概述 | 第17-21页 |
| 1.1 植物碳代谢途径的研究现状 | 第17-19页 |
| 1.2 真菌中碳代谢途径的研究现状 | 第19-20页 |
| 1.3 细菌中碳代谢途径的研究现状 | 第20-21页 |
| 第二节 碳代谢对生长发育和次级代谢的影响 | 第21-28页 |
| 2.1 碳代谢途径中中间代谢产物的研究现状 | 第21-23页 |
| 2.1.1 核苷酸糖的研究概况 | 第22页 |
| 2.1.2 Glc-1-P的研究概况 | 第22-23页 |
| 2.1.3 Glc-6-P的研究 | 第23页 |
| 2.1.4 其他关键中心代谢产物的研究 | 第23页 |
| 2.2 碳代谢合成途径中关键酶研究概况 | 第23-26页 |
| 2.2.1 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶 | 第24页 |
| 2.2.2 磷酸葡萄糖变位酶 | 第24-25页 |
| 2.2.3 多糖合成途径中的其他关键酶 | 第25-26页 |
| 2.3 与碳代谢相关的信号途径概述 | 第26-28页 |
| 2.3.1 SNF1/AMPK和mTOR途径对生长代谢的影响 | 第26-27页 |
| 2.3.2 MAPK对生长代谢的影响 | 第27-28页 |
| 2.3.3 钙离子对生长代谢的影响 | 第28页 |
| 第三节 灵芝及灵芝碳代谢的研究进展 | 第28-32页 |
| 3.1 灵芝的分类地位及药用价值 | 第28-29页 |
| 3.2 灵芝碳代谢的研究现状 | 第29-31页 |
| 3.2.1 影响灵芝多糖合成的环境因素 | 第29-30页 |
| 3.2.2 灵芝基因组解析 | 第30-31页 |
| 3.2.3 灵芝核苷酸糖生物合成途径预测 | 第31页 |
| 3.2.4 灵芝多糖合成途径中相关基因的研究 | 第31页 |
| 3.3 展望 | 第31-32页 |
| 第四节 本论文的研究意义及主要内容 | 第32-33页 |
| 4.1 研究意义 | 第32页 |
| 4.2 研究内容 | 第32-33页 |
| 第二章 灵芝碳代谢合成关键酶UGPase的功能分析 | 第33-75页 |
| 引言 | 第33-35页 |
| 第一节 灵芝ugp基因的克隆及蛋白功能的验证 | 第35-48页 |
| 1 实验材料 | 第35页 |
| 1.1 菌株、质粒、试剂 | 第35页 |
| 1.2 菌株培养 | 第35页 |
| 2 实验方法 | 第35-44页 |
| 2.1 质粒的转化和提取 | 第35-36页 |
| 2.1.1 化学法制备高效大肠杆菌感受态细胞 | 第35-36页 |
| 2.1.2 大肠杆菌的转化 | 第36页 |
| 2.1.3 碱裂解法提取质粒 | 第36页 |
| 2.2 灵芝UGPase原核表达载体的构建 | 第36-41页 |
| 2.2.1 菌丝体的收集 | 第36页 |
| 2.2.2 灵芝基因组DNA的提取(CTAB法) | 第36-37页 |
| 2.2.3 总RNA的提取 | 第37页 |
| 2.2.4 总RNA中DNA的消化 | 第37-38页 |
| 2.2.5 灵芝cDNA的制备(30μL体系) | 第38页 |
| 2.2.6 PCR验证cDNA质量 | 第38-39页 |
| 2.2.7 灵芝UGPase基因克隆 | 第39页 |
| 2.2.8 ugp基因特异片段的回收、双酶切、连接、测序及序列比对 | 第39-41页 |
| 2.3 UGPase蛋白的诱导表达 | 第41-42页 |
| 2.3.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第41-42页 |
| 2.4 UGPase蛋白纯化 | 第42-43页 |
| 2.4.1 所需溶液 | 第42页 |
| 2.4.2 纯化步骤 | 第42-43页 |
| 2.5 UGPase体外酶活的测定 | 第43-44页 |
| 2.5.1 UGPase蛋白提取 | 第43页 |
| 2.5.2 UGPase蛋白浓度测定 | 第43页 |
| 2.5.3 UGPase合成活性测定(Ciereszko et al.,2001) | 第43-44页 |
| 3 结果分析 | 第44-48页 |
| 3.1 灵芝UGPase功能域及进化树分析 | 第44-46页 |
| 3.2 UGPase蛋白的原核表达纯化 | 第46页 |
| 3.3 UGPase蛋白体外活性测定 | 第46-48页 |
| 第二节 灵芝ugp基因的功能分析 | 第48-73页 |
| 1 实验材料 | 第48页 |
| 1.1 菌株、质粒、试剂 | 第48页 |
| 1.2 菌株培养 | 第48页 |
| 2 实验方法 | 第48-57页 |
| 2.1 灵芝电击转化及转化子的筛选 | 第48-49页 |
| 2.1.1 原生质体的制备 | 第48页 |
| 2.1.2 电击转化及转化子的筛选 | 第48-49页 |
| 2.2 沉默转化子的验证 | 第49页 |
| 2.2.1 菌丝体的收集 | 第49页 |
| 2.2.2 总RNA的提取 | 第49页 |
| 2.2.3 总RNA中DNA的消化 | 第49页 |
| 2.2.4 灵芝cDNA的制备(30μL体系) | 第49页 |
| 2.2.5 PCR验证cDNA质量 | 第49页 |
| 2.3 灵芝ugp过表达菌株的构建与验证 | 第49-50页 |
| 2.3.1 灵芝基因组DNA的提取(CTAB法) | 第49页 |
| 2.3.2 潮霉素抗性基因在转化子的检测 | 第49-50页 |
| 2.4 中间代谢产物含量的测定 | 第50-51页 |
| 2.4.1 样品处理 | 第50页 |
| 2.4.2 Glc-1-P含量的测定(Bergmeyer et al.,1983) | 第50页 |
| 2.4.3 UDP-Glc含量的测定 | 第50-51页 |
| 2.5 灵芝多糖的测定 | 第51-52页 |
| 2.5.1 灵芝胞外多糖的制备 | 第51页 |
| 2.5.2 灵芝胞内多糖的制备 | 第51页 |
| 2.5.3 苯酚硫酸法测定多糖 | 第51-52页 |
| 2.6 细胞壁完整性测定 | 第52-53页 |
| 2.6.1 灵芝对细胞壁干扰剂的敏感性 | 第52页 |
| 2.6.2 灵芝细胞壁主要组分β-葡聚糖含量的测定 | 第52页 |
| 2.6.3 灵芝细胞壁主要组分几丁质含量的测定 | 第52-53页 |
| 2.6.4 细胞壁电镜 | 第53页 |
| 2.7 灵芝菌丝生长的测定 | 第53页 |
| 2.8 灵芝菌丝分叉统计 | 第53页 |
| 2.9 原生质体数目的统计 | 第53-54页 |
| 2.10 ugp沉默转化子耐胁迫检测 | 第54页 |
| 2.11 硝基蓝四唑(nitro blue tetrazolium,NBT)染色 | 第54页 |
| 2.12 荧光探针法检测胞内ROS | 第54页 |
| 2.13 胞内过氧化氢含量的测定 | 第54-55页 |
| 2.14 SOD酶活的测定 | 第55页 |
| 2.15 CAT酶活的测定 | 第55-56页 |
| 2.16 漆酶活性测定 | 第56页 |
| 2.16.1 平板检测法 | 第56页 |
| 2.16.2 分光光度法测定漆酶活性 | 第56页 |
| 2.17 纤维素酶活性检测 | 第56-57页 |
| 2.17.1 平板检测法 | 第56-57页 |
| 2.17.2 分光光度法测定纤维素酶活性 | 第57页 |
| 2.18 cAMP含量测定 | 第57页 |
| 3 结果分析 | 第57-73页 |
| 3.1 灵芝ugp基因沉默转化子的筛选 | 第57-59页 |
| 3.2 灵芝ugp基因对灵芝多糖生物合成的影响 | 第59页 |
| 3.3 灵芝ugp基因对灵芝细胞壁完整性的影响 | 第59-61页 |
| 3.4 灵芝ugp基因对灵芝菌丝生长的影响 | 第61-62页 |
| 3.5 ugp沉默菌株对H_2O_2的耐受性 | 第62页 |
| 3.6 灵芝ugp基因对灵芝胞内ROS的影响 | 第62-65页 |
| 3.7 ugp基因沉默对胞外漆酶活性及纤维素酶活的影响 | 第65-66页 |
| 3.8 ugp沉默影响灵芝胞内cAMP含量及对cAMP的敏感性 | 第66-67页 |
| 3.9 灵芝ugp基因对灵芝菌丝分叉的影响 | 第67-68页 |
| 3.10 灵芝ugp过表达分析 | 第68-73页 |
| 3.10.1 灵芝ugp过表达转化子OE::ugp的筛选 | 第68-69页 |
| 3.10.2 OE::ugp中间代谢产物含量的变化 | 第69-70页 |
| 3.10.3 OE::ugp中菌丝分叉的影响 | 第70页 |
| 3.10.4 OE::ugp中多糖含量的测定 | 第70-71页 |
| 3.10.5 OE::ugp菌株细胞壁完整性的检测 | 第71-73页 |
| 本章讨论 | 第73-75页 |
| 第三章 灵芝ugp通过调控胞内Glc-1-P水平影响胞内钙浓度进而影响菌丝生长 | 第75-89页 |
| 前言 | 第75-76页 |
| 1 实验材料 | 第76页 |
| 1.1 菌株、质粒、试剂 | 第76页 |
| 1.2 菌株培养 | 第76页 |
| 2 实验方法 | 第76-79页 |
| 2.1 菌株处理 | 第76页 |
| 2.2 菌丝分叉的测定 | 第76页 |
| 2.3 胞内钙离子水平的检测 | 第76-79页 |
| 2.3.1 胞内钙离子浓度Fluo-3AM检测 | 第76-77页 |
| 2.3.2 软件量化分析钙离子浓度 | 第77页 |
| 2.3.3 胞内钙离子相关基因的表达检测 | 第77-79页 |
| 2.4 中间代谢产物的测定 | 第79页 |
| 3 结果分析 | 第79-87页 |
| 3.1 灵芝ugp基因通过调控胞内钙离子水平来改变菌丝分叉 | 第79-81页 |
| 3.2 胞内Glc-1-P的含量影响胞内钙离子水平 | 第81-85页 |
| 3.3 胞内Glc-1-P的含量影响菌丝分叉水平 | 第85页 |
| 3.4 胞内Glc-1-P的含量影响灵芝菌丝生长 | 第85-87页 |
| 4 本章讨论 | 第87-89页 |
| 第四章 灵芝pgm基因的功能分析 | 第89-113页 |
| 引言 | 第89-90页 |
| 第一节 灵芝pgm基因的克隆及蛋白功能的验证 | 第90-96页 |
| 1 实验材料 | 第90页 |
| 1.1 菌株、质粒、试剂 | 第90页 |
| 1.2 菌株培养 | 第90页 |
| 2 实验方法 | 第90-92页 |
| 2.1 灵芝pgm基因的克隆 | 第90-91页 |
| 2.2 PGM原核表达载体的构建 | 第91页 |
| 2.3 PGM重组蛋白的原核表达与纯化 | 第91页 |
| 2.4 PGM蛋白酶活的测定 | 第91-92页 |
| 2.4.1 样品制备 | 第91-92页 |
| 2.4.2 PGM酶活测定 | 第92页 |
| 3 结果分析 | 第92-96页 |
| 3.1 灵芝PGM功能域及进化树分析 | 第92-94页 |
| 3.2 灵芝PGM蛋白的原核表达与纯化 | 第94-95页 |
| 3.3 灵芝PGM蛋白体外活性测定 | 第95-96页 |
| 第二节 灵芝pgm基因的功能分析 | 第96-111页 |
| 1 实验材料 | 第96页 |
| 1.1 菌株、质粒、试剂 | 第96页 |
| 1.2 菌株培养 | 第96页 |
| 2 实验方法 | 第96-99页 |
| 2.1 pgm沉默载体的构建 | 第96页 |
| 2.2 pgm沉默转化子的筛选 | 第96页 |
| 2.3 pgm沉默转化子的功能验证 | 第96-97页 |
| 2.3.1 胞外多糖含量的测定 | 第96页 |
| 2.3.2 胞内多糖含量的测定 | 第96-97页 |
| 2.3.3 中间代谢产物的测定 | 第97页 |
| 2.4 细胞壁完整性的检验 | 第97-98页 |
| 2.4.1 葡聚糖含量的测定 | 第97页 |
| 2.4.2 几丁质含量的测定 | 第97页 |
| 2.4.3 细胞壁干扰物胁迫生长测定 | 第97-98页 |
| 2.4.4 细胞壁电镜结构观察 | 第98页 |
| 2.5 pgm沉默转化子耐胁迫检测 | 第98页 |
| 2.6 胞内过氧化氢含量的测定 | 第98页 |
| 2.7 SOD酶活的测定 | 第98页 |
| 2.8 CAT酶活的测定 | 第98页 |
| 2.9 TCA循环中相关基因的定量检测 | 第98-99页 |
| 3 结果分析 | 第99-111页 |
| 3.1 灵芝pgm沉默转化子的筛选 | 第99-101页 |
| 3.2 灵芝pgm基因对菌丝分叉的影响 | 第101页 |
| 3.3 灵芝pgm基因对胞内钙离子浓度的影响 | 第101-102页 |
| 3.4 灵芝pgm基因对灵芝多糖合成的影响 | 第102-103页 |
| 3.5 灵芝pgm基因对灵芝菌丝生长的影响 | 第103-104页 |
| 3.6 灵芝pgm基因对灵芝细胞壁完整性的影响 | 第104-106页 |
| 3.7 灵芝pgm基因沉默对灵芝胞内氧化还原系统相关 | 第106-108页 |
| 3.8 灵芝pgm基因的沉默影响胞内线粒体数 | 第108-109页 |
| 3.9 灵芝pgm基因的沉默对TCA循环相关基因表达及关键酶活性的影响 | 第109-110页 |
| 3.10 灵芝pgm基因的沉默对线粒体膜电势及交替氧化酶的影响 | 第110-111页 |
| 本章讨论 | 第111-113页 |
| 全文总结 | 第113-115页 |
| 参考文献 | 第115-129页 |
| 创新点 | 第129-131页 |
| 文章发表情况 | 第131-133页 |
| 附录Ⅰ | 第133-137页 |
| 附录Ⅱ | 第137-139页 |
| 致谢 | 第139页 |
