| 摘要 | 第10-16页 |
| ABSTRACT | 第16-22页 |
| 缩写词表 | 第23-25页 |
| 第一章 前言 | 第25-40页 |
| 1.1 蛋白质N-糖基化 | 第25-28页 |
| 1.1.1 糖链的生物学作用 | 第25页 |
| 1.1.2 蛋白质糖基化类型和机制 | 第25-27页 |
| 1.1.3 均一化N-糖蛋白的重要性 | 第27-28页 |
| 1.2 均一化N-糖蛋白的合成策略 | 第28-30页 |
| 1.2.1 化学法 | 第29页 |
| 1.2.2 化学酶法 | 第29页 |
| 1.2.3 细胞的糖基化改造法 | 第29-30页 |
| 1.3 糖苷酶的反应机制及糖苷合成酶 | 第30-31页 |
| 1.4 ENGases在均一化N-糖肽/糖蛋白合成中的应用 | 第31-36页 |
| 1.4.1 ENGases的转糖基反应 | 第31-33页 |
| 1.4.2 ENGases的分子改造及唑啉化供体 | 第33-34页 |
| 1.4.3 均一化N-糖肽合成 | 第34页 |
| 1.4.4 均一化N-糖蛋白合成 | 第34-35页 |
| 1.4.5 ENGases合成均一化N-糖蛋白存在的问题和困难 | 第35-36页 |
| 1.5 α-L-岩藻糖苷酶与肠道微生物对碳源的代谢 | 第36-38页 |
| 1.5.1 岩藻糖基在肠道糖缀合物中的分布 | 第36-37页 |
| 1.5.2 α-L-岩藻糖苷酶在肠道微生物代谢岩藻糖苷中的作用 | 第37-38页 |
| 1.5.3 产气荚膜梭菌α-L-岩藻糖苷酶研究现状 | 第38页 |
| 1.6 本论文立题依据 | 第38-40页 |
| 第二章 肺炎链球菌来源的ENGase (EndoD)的分子改造及其突变酶的转糖基性质研究 | 第40-54页 |
| 2.1 材料与方法 | 第40-44页 |
| 2.1.1 主要试剂 | 第40-41页 |
| 2.1.2 分析方法 | 第41页 |
| 2.1.3 endoD和spGH85的克隆 | 第41-42页 |
| 2.1.4 定点突变 | 第42-43页 |
| 2.1.5 酶的异源表达和纯化 | 第43页 |
| 2.1.6 酶的水解活性测定 | 第43-44页 |
| 2.1.7 酶的转糖基活性测定 | 第44页 |
| 2.1.8 转糖基动力学参数测定 | 第44页 |
| 2.2 结果 | 第44-52页 |
| 2.2.1 EndoD突变位点的选择 | 第44-46页 |
| 2.2.2 EndoD、spGH85及突变酶的克隆/构建、异源表达和纯化 | 第46-47页 |
| 2.2.3 EndoD、spGH85及突变酶的水解活性研究 | 第47-48页 |
| 2.2.4 EndoD、spGH85及突变酶的转糖基活性研究 | 第48-50页 |
| 2.2.5 EndoD-N322A和EndoD-N322Q的转糖基动力学研究 | 第50-52页 |
| 2.3 讨论 | 第52-53页 |
| 2.4 小结 | 第53-54页 |
| 第三章 ENGases在均一化IgG合成中的应用 | 第54-69页 |
| 3.1 材料与方法 | 第55-58页 |
| 3.1.1 主要试剂和仪器 | 第55-56页 |
| 3.1.2 分析方法 | 第56页 |
| 3.1.3 EndoS的定点突变 | 第56-57页 |
| 3.1.4 酶的异源表达及纯化 | 第57页 |
| 3.1.5 Rituximab的Fc片段制备 | 第57页 |
| 3.1.6 Rituximab及其Fc片段的去糖基化处理 | 第57-58页 |
| 3.1.7 EndoD-N322Q以(Fucα1,6)GlcNAc-Fc片段为受体的转糖基反应 | 第58页 |
| 3.1.8 EndoS突变酶以(Fucα1,6)GlcNAc-rituximab为受体的转糖基反应 | 第58页 |
| 3.1.9 EndoS原始酶以(Fucα1,6)GlcNAc-rituximab为受体的转糖基反应 | 第58页 |
| 3.2 结果 | 第58-67页 |
| 3.2.1 Rituximab的Fc片段受体制备 | 第58-59页 |
| 3.2.2 EndoD-N322Q合成均一化rituximab的Fc片段 | 第59-61页 |
| 3.2.3 EndoS的定点突变 | 第61-63页 |
| 3.2.4 EndoS-D233A和EndoS-D233Q合成均一化IgG | 第63-66页 |
| 3.2.5 EndoS原始酶对IgG的糖基化改造 | 第66-67页 |
| 3.3 讨论 | 第67-68页 |
| 3.4 小结 | 第68-69页 |
| 第四章 “Block-transfer”反应及其在ENGases供体底物谱研究中的应用 | 第69-83页 |
| 4.1 材料与方法 | 第69-72页 |
| 4.1.1 主要试剂 | 第69页 |
| 4.1.2 分析方法 | 第69-70页 |
| 4.1.3 酶的分子克隆、异源表达和纯化 | 第70-71页 |
| 4.1.4 鸡卵清蛋白的N-糖链组成分析 | 第71页 |
| 4.1.5 ENGases对鸡卵清蛋白的水解反应 | 第71页 |
| 4.1.6 鸡卵清蛋白来源混合寡糖的唑啉化反应 | 第71-72页 |
| 4.1.7 ENGases突变酶以Fmoc-Asn(GlcNAc)-OH为受体的”block-transfer”反应 | 第72页 |
| 4.1.8 EndoD-N322Q以GlcNAc-CD52为受体”block-transfer”反应 | 第72页 |
| 4.2 结果 | 第72-81页 |
| 4.2.1 ENGases对鸡卵清蛋白N-糖苷的水解特异性 | 第72-75页 |
| 4.2.2 ENGases以Fmoc-Asn(GlcNAc)-OH为受体的“block transfer”反应 | 第75-80页 |
| 4.2.3 EndoD-N322Q催化“block transfer”反应合成N-糖肽 | 第80-81页 |
| 4.3 讨论 | 第81-82页 |
| 4.4 小结 | 第82-83页 |
| 第五章 产气荚膜梭菌ATCC 13124的α-L-岩藻糖苷酶的分子克隆、异源表达、酶学性质及代谢作用研究 | 第83-118页 |
| 5.1 材料与方法 | 第83-91页 |
| 5.1.1 主要试剂和仪器 | 第83-84页 |
| 5.1.2 菌株、质粒和培养条件 | 第84页 |
| 5.1.3 α-L-岩藻糖苷酶序列分析 | 第84-85页 |
| 5.1.4 α-L-岩藻糖苷酶的分子克隆、异源表达和纯化 | 第85-87页 |
| 5.1.5 α-L-岩藻糖苷酶的酶学性质测定 | 第87-89页 |
| 5.1.6 产气荚膜梭菌ATCC 13124生长曲线测定 | 第89页 |
| 5.1.7 RT-qPCR | 第89-91页 |
| 5.1.8 产气荚膜梭菌ATCC 13124的α-L-岩藻糖苷酶活性测定 | 第91页 |
| 5.1.9 产气荚膜梭菌ATCC 13124对岩藻糖基化寡糖的降解 | 第91页 |
| 5.2 结果 | 第91-113页 |
| 5.2.1 产气荚膜梭菌ATCC 13124中三个-L-岩藻糖苷酶的序列分析 | 第91-96页 |
| 5.2.2 CpAfc1、CpAfc2和CpAfc3的分子克隆、异源表达和纯化 | 第96-97页 |
| 5.2.3 CpAfc1、CpAfc2和CpAfc3的酶学性质研究 | 第97-102页 |
| 5.2.4 产气荚膜梭菌ATCC 13124在不同碳源中的生长及α-L-岩藻糖苷酶的产生 | 第102-113页 |
| 5.3 讨论 | 第113-116页 |
| 5.3.1 CpAfc1、CpAfc2和CpAfc3与产气荚膜梭菌ATCC 13124对岩藻糖苷的利用 | 第113-114页 |
| 5.3.2 CpAfc2和CpAfc3在产气荚膜梭菌ATCC 13124黏蛋白降解中的作用 | 第114-115页 |
| 5.3.3 产气荚膜梭菌ATCC 13124对岩藻糖苷的代谢偏好性 | 第115-116页 |
| 5.3.4 α-L-岩藻糖苷酶在产气荚膜梭菌中的分布 | 第116页 |
| 5.4 小结 | 第116-118页 |
| 附录1. Rituximab的Fc N-糖链结构分析 | 第118-119页 |
| 参考文献 | 第119-128页 |
| 论文发表与专利申请 | 第128-129页 |
| 致谢 | 第129-130页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第130页 |
