| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-21页 |
| 1. 真菌细胞壁的结构与组成 | 第11-15页 |
| 1.1 真菌细胞壁的组成 | 第11-13页 |
| 1.1.1 葡聚糖 | 第11页 |
| 1.1.2 几丁质 | 第11-12页 |
| 1.1.3 壳聚糖 | 第12-13页 |
| 1.1.4 糖蛋白 | 第13页 |
| 1.2 真菌细胞壁的结构 | 第13-14页 |
| 1.3 真菌细胞壁的功能 | 第14页 |
| 1.4 真菌细胞壁的重构 | 第14-15页 |
| 2. 几丁质酶的分类与功能 | 第15-18页 |
| 2.1 几丁质酶的分类和水解机制 | 第15-18页 |
| 2.1.1 几丁质酶的水解机制 | 第15-16页 |
| 2.1.2 几丁质酶的分类 | 第16-18页 |
| 2.2 几丁质酶的功能 | 第18页 |
| 3. 构巢曲霉几丁质酶研究进展 | 第18-20页 |
| 4. 本论文的研究内容及意义 | 第20-21页 |
| 第二章 构巢曲霉几丁质酶ChiB异源重组表达及酶学性质研究 | 第21-55页 |
| 第一节 构曲霉几丁质酶ChiB基因原核重组表达 | 第21-36页 |
| 1. 材料与方法 | 第21-32页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第21页 |
| 1.2 试剂和仪器 | 第21-22页 |
| 1.3 培养基的配制 | 第22-23页 |
| 1.4 主要溶液的配置 | 第23页 |
| 1.5 构巢曲霉子实体的培养方法 | 第23-24页 |
| 1.6 ChiB基因片段的优化与合成以及基因片段的扩增 | 第24页 |
| 1.7 质粒pET28A(+)的提取及双酶切 | 第24-25页 |
| 1.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第25页 |
| 1.9 重组质粒的构建及感受态细胞的转化 | 第25-26页 |
| 1.10 阳性克隆的筛选 | 第26-27页 |
| 1.11 重组质粒pET28A(+)-ChiB的提取 | 第27页 |
| 1.12 大肠杆菌E.coli Rosetta感受态细胞的制备 | 第27页 |
| 1.13 表达菌pET28A(+)-ChiB -E.coli Rosetta的构建 | 第27页 |
| 1.14 表达菌阳性克隆的筛选 | 第27-28页 |
| 1.15 ChiB基因的诱导表达 | 第28页 |
| 1.16 粗酶液的制备 | 第28-29页 |
| 1.17 粗酶液活性的测定(DNS法) | 第29-30页 |
| 1.18 重组蛋白ChiB的分离纯化 | 第30页 |
| 1.19 透析除去蛋白洗脱液中的咪唑,并且测蛋白含量 | 第30-31页 |
| 1.20 SDS-PAGE检测蛋白表达 | 第31-32页 |
| 2. 实验结果 | 第32-34页 |
| 2.1 pET28A(+)-ChiB重组质粒的构建 | 第32-33页 |
| 2.2 ChiB蛋白的SDS-PAGE鉴定 | 第33-34页 |
| 3. 讨论 | 第34-36页 |
| 第二节 构巢曲霉几丁质酶ChiB的酶学性质研究 | 第36-55页 |
| 1. 材料与方法 | 第36-42页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第36页 |
| 1.2 试剂与仪器 | 第36-37页 |
| 1.3 底物特异性的测定 | 第37-38页 |
| 1.4 ChiB最适温度和温度稳定性的测定 | 第38页 |
| 1.5 ChiB最适pH和pH稳定性的测定 | 第38-39页 |
| 1.6 金属离子对几丁质酶ChiB活性的影响 | 第39页 |
| 1.7 几丁质酶ChiB对pNP衍生几丁质寡糖的水解活性的测定 | 第39页 |
| 1.8 几丁质酶ChiB反应动力学参数 | 第39-40页 |
| 1.9 几丁质酶ChiB对几丁质寡糖的水解 | 第40页 |
| 1.10 几丁质酶ChiB对(GlcNAc)1.3 -pNP的水解 | 第40-41页 |
| 1.11 几丁质酶ChiB对胶态几丁质的水解 | 第41页 |
| 1.12 几丁质酶ChiB对几丁质粉末的水解 | 第41页 |
| 1.13 HPAEC-PAD分析 | 第41-42页 |
| 1.14 几丁质酶ChiB进化树分析 | 第42页 |
| 2. 结果 | 第42-53页 |
| 2.1 ChiB的底物特异性分析 | 第42页 |
| 2.2 ChiB的最适温度和温度稳定性 | 第42-44页 |
| 2.3 ChiB的最适pH和pH稳定性 | 第44-45页 |
| 2.4 金属离子对几丁质酶ChiB活性的影响 | 第45页 |
| 2.5 几丁质酶ChiB对pNP衍生几丁质寡糖的水解活性的测定 | 第45-46页 |
| 2.6 几丁质酶ChiB反应动力学参数 | 第46页 |
| 2.7 几丁质酶ChiB对几丁质寡糖的水解产物分析 | 第46-50页 |
| 2.8 几丁质酶ChiB对(GlcNAc)1-3 -pNP的水解产物分析 | 第50页 |
| 2.9 几丁质酶ChiB对胶态几丁质的水解产物分析 | 第50-51页 |
| 2.10 几丁质酶ChiB对几丁质粉末的水解产物分析 | 第51-52页 |
| 2.11 几丁质酶ChiB进化树分析 | 第52-53页 |
| 3. 讨论 | 第53-55页 |
| 第三章 构巢曲霉几丁质酶ChiB的生理功能研究 | 第55-71页 |
| 第一节 构巢曲霉几丁质酶ChiB-GFP菌株的构建 | 第55-65页 |
| 1 材料与方法 | 第55-62页 |
| 1.1 实验材料 | 第55页 |
| 1.2 试剂 | 第55-56页 |
| 1.3 培养基及培养条件 | 第56页 |
| 1.4 构巢曲霉子实体的培养 | 第56页 |
| 1.5 构巢曲霉总DNA的提取 | 第56-57页 |
| 1.6 引物的设计与合成 | 第57页 |
| 1.7 ChiB基因终止子上游1000bp与下游1000bp片段的扩增 | 第57-58页 |
| 1.8 GFP-pyrG片段的扩增 | 第58-59页 |
| 1.9 ChiB-GFP-pyrG片段的融合 | 第59-60页 |
| 1.10 重组质粒pEASY-ChiB-GFP-pyrG的构建及感受态细胞的转化 | 第60页 |
| 1.11 重组的大肠杆菌pEASY -ChiB-GFP-pyrG/Trans1-T1菌株阳性克隆的筛选 | 第60-61页 |
| 1.12 构巢曲霉的转化 | 第61-62页 |
| 1.13 构巢曲霉ChiB-GFP阳性菌株的验证 | 第62页 |
| 2. 结果 | 第62-65页 |
| 2.1 ChiB基因终止子上游1000bp、下游1000bp和GFP-pyrG片段的扩增产物鉴定 | 第62-63页 |
| 2.2 ChiB-GFP-pyrG融合片段的鉴定 | 第63-64页 |
| 2.3 重组质粒pEASY -ChiB-GFP-pyrG/Trans1-T1阳性克隆结果鉴定 | 第64页 |
| 2.4 构巢曲霉ChiB-GFP菌株阳性克隆结果鉴定 | 第64-65页 |
| 第二节 构巢曲霉几丁质酶ChiB生理功能研究 | 第65-71页 |
| 1. 材料与方法 | 第65-68页 |
| 1.1 菌株 | 第65页 |
| 1.2 试剂与仪器 | 第65页 |
| 1.3 培养基及其配置方法 | 第65-66页 |
| 1.4 野生型菌株的培养和ChiB-GFP菌株的培养 | 第66页 |
| 1.5 ChiB-GFP菌株的荧光观察 | 第66-67页 |
| 1.6 灰盖鬼伞培养基与培养条件 | 第67页 |
| 1.7 灰盖鬼伞菌柄酸伸长活性的检测 | 第67页 |
| 1.8 灰盖鬼伞热灭活的菌柄重构伸长活性的检测 | 第67-68页 |
| 2. 结果 | 第68-69页 |
| 2.1 构巢曲霉ChiB-GFP菌株的荧光观察 | 第68页 |
| 2.2 构巢曲霉ChiB几丁质酶作用于热灭活的灰盖鬼伞菌柄生长区域的检测 | 第68-69页 |
| 3. 讨论 | 第69-71页 |
| 第四章 全文总结 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-80页 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
