| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第12-25页 |
| 1.1 HBV基因组结构和病毒感染复制过程 | 第12-15页 |
| 1.2 乙型肝炎的治疗现状 | 第15-19页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术 | 第19-23页 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas系统的结构与分类 | 第19-20页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9系统的作用机理 | 第20-22页 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9技术在基因治疗中的研究进展 | 第22-23页 |
| 1.3.4 CRISPR/Cas9技术在乙肝治疗中的研究进展 | 第23页 |
| 1.4 本课题研究思路 | 第23-25页 |
| 第二章 HBV特异性CRISPR/Cas9系统的设计和构建 | 第25-38页 |
| 2.1 实验仪器与材料 | 第25-27页 |
| 2.1.1 主要仪器设备 | 第25-26页 |
| 2.1.2 质粒及菌株 | 第26页 |
| 2.1.3 实验试剂与耗材 | 第26页 |
| 2.1.4 实验相关溶液和培养基配制 | 第26-27页 |
| 2.2 实验方法 | 第27-33页 |
| 2.2.1 sgRNA的设计和选择 | 第27-28页 |
| 2.2.2 U6-sgRNA表达载体构建 | 第28-33页 |
| 2.3 实验结果 | 第33-36页 |
| 2.3.1 线性化U6-gRNA表达质粒制备 | 第33-34页 |
| 2.3.2 U6-sgRNA重组质粒构建 | 第34-35页 |
| 2.3.3 无内毒素U6-sgRNA重组质粒制备 | 第35-36页 |
| 2.4 小结与讨论 | 第36-38页 |
| 第三章 CRISPR/Cas9系统体外抑制HBV复制和抗原表达研究 | 第38-52页 |
| 3.1 实验仪器与材料 | 第38-40页 |
| 3.1.1 主要仪器设备 | 第38页 |
| 3.1.2 质粒及菌株 | 第38-39页 |
| 3.1.3 实验试剂与耗材 | 第39页 |
| 3.1.4 实验相关溶液和培养基配制 | 第39-40页 |
| 3.2 实验方法 | 第40-45页 |
| 3.2.1 HepG2.2.15细胞培养 | 第40-41页 |
| 3.2.2 HepG2.2.15细胞高效转染方案的建立 | 第41-42页 |
| 3.2.3 U6-sgRNA重组质粒和hCas9质粒共转染HepG2.2.15细胞 | 第42-43页 |
| 3.2.4 ETV处理HepG2.2.15细胞 | 第43页 |
| 3.2.5 qPCR检测HBVDNA含量 | 第43-44页 |
| 3.2.6 ECLIA检测HBsAg含量 | 第44-45页 |
| 3.2.7 统计学分析 | 第45页 |
| 3.3 实验结果 | 第45-48页 |
| 3.3.1 两种转染方案对HepG2.2.15细胞转染效率的比较 | 第45-46页 |
| 3.3.2 CRISPR/Cas9系统对HBVDNA复制的抑制作用 | 第46-47页 |
| 3.3.3 CRISPR/Cas9系统对HBsAg表达的抑制作用 | 第47-48页 |
| 3.4 小结与讨论 | 第48-52页 |
| 第四章 CRISPR/Cas9切割cccDNA诱导宿主细胞HBV整合风险研究 | 第52-65页 |
| 4.1 实验仪器与材料 | 第52-53页 |
| 4.1.1 主要仪器设备 | 第52-53页 |
| 4.1.2 质粒及细胞株 | 第53页 |
| 4.1.3 实验试剂与耗材 | 第53页 |
| 4.1.4 主要溶液的配制 | 第53页 |
| 4.1.5 生物信息分析软件 | 第53页 |
| 4.2 实验方法 | 第53-59页 |
| 4.2.1 细胞分组与转染 | 第53-55页 |
| 4.2.2 DNA文库构建及全基因组测序分析 | 第55-59页 |
| 4.3 实验结果 | 第59-63页 |
| 4.3.1 CRISPR/Cas9介导GFP报告系统整合分析 | 第59-60页 |
| 4.3.2 CRISPR/Cas9切割cccDNA诱导基因组整合分析 | 第60-63页 |
| 4.4 小结与讨论 | 第63-65页 |
| 结论与展望 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-72页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 附录 | 第74页 |
