| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-21页 |
| 1.1 颠茄概括 | 第11-12页 |
| 1.2 托品烷类生物碱概述 | 第12-13页 |
| 1.2.1 托品烷类生物碱的结构及性质 | 第12页 |
| 1.2.2 TAs在植物类群和植物体中的分布 | 第12-13页 |
| 1.3 TAs的生物合成 | 第13-17页 |
| 1.3.1 TAs生物合成途径 | 第13-14页 |
| 1.3.2 TAs生物合成途径上的酶和基因 | 第14-16页 |
| 1.3.3 外界诱导对TAs生物合成的影响 | 第16-17页 |
| 1.4 托品酮还原酶及其代谢工程研究进展 | 第17-21页 |
| 1.4.1 托品酮还原酶研究进展 | 第17-18页 |
| 1.4.2 以TRs为靶点的代谢工程研究进展 | 第18-21页 |
| 第2章 绪论 | 第21-23页 |
| 2.1 研究目的和意义 | 第21页 |
| 2.2 研究范围和内容 | 第21-22页 |
| 2.3 技术路线 | 第22-23页 |
| 第3章 材料与方法 | 第23-39页 |
| 3.1 实验材料及试剂耗材 | 第23-25页 |
| 3.1.1 植物材料 | 第23页 |
| 3.1.2 菌株和质粒 | 第23页 |
| 3.1.3 仪器和设备 | 第23页 |
| 3.1.4 试剂盒及试剂购买 | 第23-24页 |
| 3.1.5 常规试剂和培养基的配制 | 第24-25页 |
| 3.2 常规方法和操作步骤 | 第25-28页 |
| 3.2.1 总RNA的提取与检测 | 第25-26页 |
| 3.2.2 DNA产物的琼脂糖凝胶电泳 | 第26页 |
| 3.2.3 目的条带的回收 | 第26页 |
| 3.2.4 连接反应 | 第26页 |
| 3.2.5 大肠杆菌DH5α/Rosetta感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第26-27页 |
| 3.2.6 连接产物或重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞 | 第27页 |
| 3.2.7 重组子的鉴定、测序 | 第27页 |
| 3.2.8 质粒的提取 | 第27页 |
| 3.2.9 SDS法抽提颠茄基因组DNA | 第27-28页 |
| 3.3 AbTRL基因的克隆与分析 | 第28-33页 |
| 3.3.1 颠茄总RNA的提取与检测 | 第28页 |
| 3.3.2 从颠茄总RNA合成第一链cDNA | 第28页 |
| 3.3.3 AbTRL1基因的克隆 | 第28-31页 |
| 3.3.4 AbTRL1、AbTRL2基因的生物信息学分析 | 第31页 |
| 3.3.5 qPCR检测 | 第31-32页 |
| 3.3.6 AbTRs基因的数字表达谱分析 | 第32页 |
| 3.3.7 AbTRL1、AbTRL2基因的诱导表达谱分析 | 第32-33页 |
| 3.4 AbTRL1、AbTRL2基因的原核表达 | 第33-36页 |
| 3.4.1 AbTRL1、AbTRL2基因原核表达载体构建及工程菌的获得 | 第33-34页 |
| 3.4.2 AbTRL重组蛋白的少量诱导表达 | 第34-35页 |
| 3.4.3 AbTRL重组蛋白的大量诱导及分离纯化 | 第35-36页 |
| 3.4.4 Bradford法测定蛋白含量 | 第36页 |
| 3.5 AbTRL重组蛋白的功能验证 | 第36-37页 |
| 3.5.1 AbTRL重组蛋白酶活测定 | 第36页 |
| 3.5.2 AbTRL2重组蛋白氧化还原反应酶活pH梯度绘制 | 第36-37页 |
| 3.6 AbTRL1活性位点突变 | 第37-39页 |
| 3.6.1 AbTRL1-Y110H定点突变 | 第37-38页 |
| 3.6.2 AbTRL1-Y110H原核表达载体的构建 | 第38页 |
| 3.6.3 AbTRL1-Y110H蛋白的诱导与纯化 | 第38页 |
| 3.6.4 重组蛋白AbTRL1-Y110H酶活测定 | 第38-39页 |
| 第4章 结果与分析 | 第39-57页 |
| 4.1 AbTRL1基因全长cDNA的获得与分析 | 第39-48页 |
| 4.1.1 AbTRL1基因的获得 | 第39页 |
| 4.1.2 AbTRL1基因的生物信息学分析 | 第39-46页 |
| 4.1.3 AbTRL1基因荧光定量引物的特异性分析 | 第46页 |
| 4.1.4 AbTs基因的数字表达谱分析 | 第46-47页 |
| 4.1.5 AbTRL1、AbTRL2基因的诱导谱分析 | 第47-48页 |
| 4.2 AbTRL1、AbTRL2基因的原核表达 | 第48-52页 |
| 4.2.1 AbTRL1、AbTRL2基因原核表达载体的构建 | 第48-49页 |
| 4.2.2 重组AbTRL1、AbTRL2蛋白的少量诱导表达 | 第49-50页 |
| 4.2.3 重组AbTRL1、AbTRL2蛋白的纯化 | 第50-51页 |
| 4.2.4 Bradford法蛋白浓度测定标准曲线 | 第51-52页 |
| 4.3 AbTRL1、AbTRL2基因的功能验证 | 第52-54页 |
| 4.3.1 重组蛋白AbTRL1、AbTRL2酶活测定 | 第52-53页 |
| 4.3.2 重组蛋白AbTRL2酶活pH梯度 | 第53-54页 |
| 4.4 AbTRL1活性位点突变 | 第54-57页 |
| 4.4.1 AbTRL1-Y110H定点突变 | 第54页 |
| 4.4.4 重组蛋白AbTRL1-Y110H酶活测定 | 第54-57页 |
| 第5章 结论与展望 | 第57-59页 |
| 5.1 实验结论与讨论 | 第57-58页 |
| 5.2 试验展望 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-65页 |
| 附录 | 第65-69页 |
| 缩写词表 | 第65-67页 |
| 致谢 | 第67-69页 |
| 研究生期间发表论文、参研项目 | 第69页 |
