| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 前言 | 第12-31页 |
| 1 O-GlcNAc 转移酶(OGT) | 第12-13页 |
| 2 O-GlcNAc 转移酶的结构与功能 | 第13-20页 |
| 2.1 三种不同 OGT 亚型 | 第13-15页 |
| 2.2 TPR 结构及功能 | 第15-17页 |
| 2.3 多个结构域的催化区域 | 第17-20页 |
| 3 O-GlcNAc 转移酶的催化机制 | 第20-23页 |
| 4 O-GlcNAc 的测定方法 | 第23-29页 |
| 4.1 使用放射性标记的糖基供体底物检测 | 第23-24页 |
| 4.2 使用 O-GlcNAc 抗体检测 | 第24-25页 |
| 4.3 使用凝集素法检测 | 第25页 |
| 4.4 高通量的测定方法 | 第25-29页 |
| 4.4.1 荧光的 UDP-GlcNAc 类似物的置换试验 | 第26-27页 |
| 4.4.2 “蛋白酶-保护”分析策略在 OGT 活性中的应用 | 第27-28页 |
| 4.4.3 叠氮酶联免疫吸附测定 | 第28-29页 |
| 5 总结和展望 | 第29-31页 |
| 第一章 OGT 突变体的构建及其重组表达 | 第31-51页 |
| 1 实验材料 | 第31-36页 |
| 1.1 菌株和载体 | 第31页 |
| 1.2 主要仪器 | 第31-32页 |
| 1.3 主要试剂 | 第32-34页 |
| 1.4 主要溶液的配置 | 第34-36页 |
| 2 实验方法 | 第36-47页 |
| 2.1 构建 OGT 的突变体 | 第36-44页 |
| 2.1.1 点突变原理 | 第36-37页 |
| 2.1.2 突变引物设计 | 第37-38页 |
| 2.1.3 PCR 扩增 OGT 突变体序列 | 第38-39页 |
| 2.1.4 OGT 突变体 DNA 片段的琼脂糖凝胶回收实验 | 第39-40页 |
| 2.1.5 突变体 DNA 片段的末端平滑化，以及 5′末端的磷酸化实验 | 第40-41页 |
| 2.1.6 突变体 DNA 的连接反应 | 第41页 |
| 2.1.7 突变体 DNA 的转化 | 第41-42页 |
| 2.1.8 碱裂解法提取 OGT 突变体质粒 | 第42-43页 |
| 2.1.9 酶切鉴定 OGT 突变体质粒 | 第43-44页 |
| 2.2 OGT 突变体的重组表达 | 第44-47页 |
| 2.2.1 样品的制备和处理 | 第44-45页 |
| 2.2.2 SDS-PAGE 电泳 | 第45-46页 |
| 2.2.3 OGT 突变体的免疫印迹检测（Western Blot） | 第46-47页 |
| 3 实验结果 | 第47-50页 |
| 3.1 OGT 蛋白的重组表达 | 第47-49页 |
| 3.1.1 mutOGT 原核表达载体的构建 | 第47-49页 |
| 3.2 OGT 的重组表达 | 第49-50页 |
| 4 小结 | 第50-51页 |
| 第二章 OGT 底物蛋白的构建及其重组表达 | 第51-68页 |
| 1 实验材料 | 第51-56页 |
| 1.1 菌株和载体 | 第51页 |
| 1.2 主要仪器 | 第51-52页 |
| 1.3 主要试剂 | 第52-54页 |
| 1.4 主要溶液的配置 | 第54-56页 |
| 2 实验方法 | 第56-63页 |
| 2.1 构建重组载体 pET30a-CKⅡ | 第56-62页 |
| 2.1.1 构建 CKⅡ片段的引物设计 | 第56页 |
| 2.1.2 用 Trizol 法提取细胞内的总 RNA | 第56-57页 |
| 2.1.3 对 RNA 进行反转录 PCR 制备 cDNA | 第57-58页 |
| 2.1.4 CKⅡ基因片段的 PCR 扩增 | 第58-59页 |
| 2.1.5 CKⅡ基因片段的琼脂糖凝胶回收实验 | 第59页 |
| 2.1.6 CKⅡ基因片段和 PMD18-T 载体的连接实验 | 第59页 |
| 2.1.7 重组质粒载体 PMD18-T-CKⅡ的转化 | 第59-60页 |
| 2.1.8 重组载体 PMD18-T-CKⅡ质粒的提取 | 第60页 |
| 2.1.9 重组载体质粒 PMD18-T-CKⅡ的酶切鉴定 | 第60页 |
| 2.1.10 重组载体质粒 PMD18-T-CKⅡ的酶切、胶回收 | 第60-61页 |
| 2.1.11 载体 pET30a 质粒的酶切、胶回收 | 第61页 |
| 2.1.12 基因片段 CKⅡ和载体片段 pET-30a 的连接 | 第61-62页 |
| 2.1.13 重组载体质粒 pET30a-CKⅡ的转化以及质粒的提取 | 第62页 |
| 2.1.14 重组载体质粒 pET30a-CKⅡ的酶切鉴定 | 第62页 |
| 2.2 OGT 底物蛋白的重组表达 | 第62-63页 |
| 2.2.1 CKⅡ的重组表达 | 第62-63页 |
| 2.2.2 Sp1 的重组表达 | 第63页 |
| 3 实验结果 | 第63-67页 |
| 3.1 CKⅡ的重组表达和纯化 | 第63-66页 |
| 3.1.1 CKⅡ原核表达载体的构建 | 第63-64页 |
| 3.1.2 CKⅡ的重组表达 | 第64-66页 |
| 3.2 Sp1 的重组表达 | 第66-67页 |
| 4 小结 | 第67-68页 |
| 第三章 OGT 突变体的活性检测 | 第68-91页 |
| 1 实验材料 | 第68-72页 |
| 1.1 菌株和载体 | 第68页 |
| 1.2 主要仪器 | 第68-69页 |
| 1.3 主要试剂 | 第69-70页 |
| 1.4 主要溶液的配置 | 第70-72页 |
| 2 实验方法 | 第72-75页 |
| 2.1 底物蛋白和 OGT 及其突变体原核共表达检测 OGT 活性 | 第72-73页 |
| 2.1.1 构建 CKⅡ和 OGT 及其突变体的原核共表达菌株 | 第72-73页 |
| 2.1.2 CKⅡ和 OGT 及其突变体的原核共表达检测 OGT 活性 | 第73页 |
| 2.2 OGT突变体的重组表达 | 第73-74页 |
| 2.2.1 构建 Sp1 和 OGT 及其突变体的原核共表达菌株 | 第73页 |
| 2.2.2 Sp1 和 OGT 及其突变体的原核共表达检测 OGT 活性 | 第73-74页 |
| 2.3 底物蛋白和 OGT 及其突变体体外试验检测 OGT 活性 | 第74-75页 |
| 2.3.1 CKⅡ和 OGT 及其突变体体外试验检测 OGT 活性 | 第74页 |
| 2.3.2 Sp1 和 OGT 及其突变体体外试验检测 OGT 活性 | 第74-75页 |
| 3 实验结果 | 第75-90页 |
| 3.1 共表达系统中 OGT 酶活的研究 | 第75-86页 |
| 3.1.1 OGT 蛋白与底物蛋白的原核共表达 | 第75-78页 |
| 3.1.2 共表达体系中 OGT 的酶活性位点 | 第78-85页 |
| 3.1.3 小结 | 第85-86页 |
| 3.2 OGT 的体外酶活性研究 | 第86-90页 |
| 3.2.1 OGT 在体外对 CKⅡ的催化 | 第86-88页 |
| 3.2.2 OGT 在体外对 Sp1 的催化 | 第88-89页 |
| 3.2.3 小结 | 第89-90页 |
| 4 展望 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 个人简介 | 第95页 |
| 在读期间的学术成果 | 第95-96页 |
