| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 目录 | 第8-11页 |
| 符号说明 | 第11-13页 |
| 1 绪论 | 第13-16页 |
| 一、P19胚胎瘤细胞 | 第13-14页 |
| 二、MAGE基因家族 | 第14页 |
| 三、Necdin | 第14-16页 |
| 2 稳定转染Pcmv-tag2B-Necdin对P19细胞周期和增殖的影响 | 第16-25页 |
| 2.1 材料 | 第16页 |
| 2.1.1 细胞 | 第16页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第16页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第16页 |
| 2.2 方法和步骤 | 第16-20页 |
| 2.2.1 溶液配制 | 第16-17页 |
| 2.2.2 细胞复苏、传代培养 | 第17-18页 |
| 2.2.3 WesternBlot方法验证Flag-Necdin的表达 | 第18-19页 |
| 2.2.4 流式细胞术检测Necdin对P19细胞周期的影响 | 第19-20页 |
| 2.2.5 CCK-8检测Flag-Necdin对P19细胞增殖速率的影响 | 第20页 |
| 2.3. 结果 | 第20-23页 |
| 2.3.1 稳定转染pCMV-tag2B-Necdin的细胞克隆高表达Flag-Necdin | 第20-21页 |
| 2.3.2 稳定表达Flag-Necdin后P19细胞周期无明显变化 | 第21-22页 |
| 2.3.3 稳定表达Flag-Necdin后P19细胞增殖无明显变化 | 第22-23页 |
| 2.4 本章小结 | 第23页 |
| 2.5 讨论 | 第23-25页 |
| 3 稳定转染PcDNA3.1-Necdin对P19细胞周期和增殖的影响 | 第25-52页 |
| 3.1 真核表达载体构建 | 第25-36页 |
| 3.1.1 材料 | 第25-26页 |
| 3.1.1.1 动物及菌种 | 第25页 |
| 3.1.1.2 主要实验试剂 | 第25页 |
| 3.1.1.3 主要仪器设备 | 第25-26页 |
| 3.1.2 方法和步骤 | 第26-32页 |
| 3.1.2.1 引物设计 | 第26-27页 |
| 3.1.2.2 溶液配制 | 第27页 |
| 3.1.2.3 感受态制备 | 第27-28页 |
| 3.1.2.4 真核表达载体构建及鉴定 | 第28-32页 |
| 3.1.2.5 真核表达载体体外瞬时表达活性检测 | 第32页 |
| 3.1.3 结果 | 第32-36页 |
| 3.1.3.1 目的基因PCR扩增结果 | 第32-33页 |
| 3.1.3.2 真核表达载体的构建和酶切鉴定 | 第33-34页 |
| 3.1.3.3 构建载体测序结果 | 第34页 |
| 3.1.3.4 真核表达载体体外瞬时表达活性检测 | 第34-36页 |
| 3.2 稳定转染PcDNA3.1-Necdin的P19细胞克隆的制备 | 第36-45页 |
| 3.2.1 材料 | 第36页 |
| 3.2.1.1 细胞及载体 | 第36页 |
| 3.2.1.2 主要试剂 | 第36页 |
| 3.2.1.3 主要仪器设备 | 第36页 |
| 3.2.2 方法及步骤 | 第36-39页 |
| 3.2.2.1 溶液配制 | 第36-37页 |
| 3.2.2.2 P19细胞复苏、传代培养 | 第37-38页 |
| 3.2.2.3 确定G418筛选P19细胞的最佳浓度 | 第38页 |
| 3.2.2.4 制备稳定过表达Necdin的P19细胞克隆 | 第38-39页 |
| 3.2.3 结果 | 第39-43页 |
| 3.2.3.1 PcDNA3.1-Necdin和PcDNA3.1质粒浓度及纯度测定 | 第39页 |
| 3.2.3.2 P19细胞生长状态良好 | 第39-40页 |
| 3.2.3.3 确定G418筛选P19细胞的最佳浓度为800μg/mL | 第40页 |
| 3.2.3.4 鉴定得到稳定过表达Necdin的P19细胞单克隆 | 第40-43页 |
| 3.2.4 讨论 | 第43-45页 |
| 一、脂质体转染方法 | 第43页 |
| 二、影响目的基因表达的因素 | 第43-44页 |
| 三、目的基因表达产物检测 | 第44-45页 |
| 3.3 稳定转染PcDNA3.1-Necdin对P19细胞周期和增殖的影响 | 第45-49页 |
| 3.3.1. 材料 | 第45页 |
| 3.3.1.1 细胞克隆 | 第45页 |
| 3.3.1.2 主要试剂 | 第45页 |
| 3.3.1.3 主要仪器设备 | 第45页 |
| 3.3.2 方法和步骤 | 第45-46页 |
| 3.3.2.1 稳定转染重组质粒PcDNA3.1-Necdin后Necdin表达情况 | 第45-46页 |
| 3.3.2.2 流式细胞术检测Necdin对P19细胞周期的影响 | 第46页 |
| 3.3.2.3 CCK-8检测Flag-Necdin对P19细胞增殖速率的影响 | 第46页 |
| 3.3.3 结果 | 第46-49页 |
| 3.3.3.1 稳定转染PcDNA3.1-Necdin的细胞克隆高表达Necdin | 第46-47页 |
| 3.3.3.2 稳定过表达Necdin后P19细胞周期无明显变化 | 第47-48页 |
| 3.3.3.3 稳定过表达Necdin后P19细胞增殖无明显变化 | 第48-49页 |
| 3.4 本章小结 | 第49页 |
| 3.5 讨论 | 第49-52页 |
| 4 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-57页 |
| 文献综述 | 第57-61页 |
| 参考文献 | 第59-61页 |
| 附件1 | 第61-62页 |
| 附件2 | 第62-63页 |
| 附件3 | 第63-66页 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
