| 符号说明 | 第5-11页 |
| 中文摘要 | 第11-14页 |
| Abstract | 第14-17页 |
| 1 前言 | 第18-32页 |
| 1.1 有机磷农药的残留及危害 | 第18-20页 |
| 1.1.1 有机磷农药对环境的影响 | 第18页 |
| 1.1.2 有机磷农药对人身体健康的影响 | 第18-20页 |
| 1.1.2.1 急性中毒 | 第19页 |
| 1.1.2.2 慢性中毒 | 第19-20页 |
| 1.2 有机磷农药检测技术的研究进展 | 第20-25页 |
| 1.2.1 酶抑制法 | 第20页 |
| 1.2.2 仪器分析法 | 第20-22页 |
| 1.2.2.1 气相色谱法 | 第21页 |
| 1.2.2.2 高效液相色谱法 | 第21-22页 |
| 1.2.2.3 色谱-质谱联用法 | 第22页 |
| 1.2.3 免疫分析法 | 第22-25页 |
| 1.2.3.1 荧光免疫分析法 | 第23页 |
| 1.2.3.2 胶体金免疫层析法 | 第23页 |
| 1.2.3.3 化学发光免疫分析法 | 第23-24页 |
| 1.2.3.4 电化学发光免疫分析法 | 第24页 |
| 1.2.3.5 酶联免疫分析法 | 第24-25页 |
| 1.3 噬菌体展示技术及其在免疫分析中的应用 | 第25-28页 |
| 1.3.1 噬菌体展示技术原理 | 第25-26页 |
| 1.3.2 噬菌体展示体系分类 | 第26页 |
| 1.3.3 噬菌体展示技术在免疫分析中的应用 | 第26-28页 |
| 1.3.3.1 噬菌体展示随机肽库在免疫分析中的应用 | 第26-27页 |
| 1.3.3.2 噬菌体展示抗体库在免疫分析中的应用 | 第27-28页 |
| 1.4 农药残留样品的净化方法 | 第28-31页 |
| 1.4.1 固相萃取法 | 第28-29页 |
| 1.4.2 QuEChERS法 | 第29-30页 |
| 1.4.3 固相微萃取法 | 第30页 |
| 1.4.4 液-液微萃取法 | 第30页 |
| 1.4.5 超声辅助萃取法 | 第30-31页 |
| 1.4.6 微波辅助萃取法 | 第31页 |
| 1.5 本课题的目的和意义 | 第31-32页 |
| 2 材料与方法 | 第32-67页 |
| 2.1 材料 | 第32-39页 |
| 2.1.1 噬菌体展示肽库及宿主菌 | 第32页 |
| 2.1.2 载体与菌株 | 第32页 |
| 2.1.3 实验动物 | 第32页 |
| 2.1.4 主要生化试剂 | 第32-33页 |
| 2.1.5 主要仪器设备 | 第33页 |
| 2.1.6 培养基和试剂的配制 | 第33-35页 |
| 2.1.6.1 培养基的配制 | 第34页 |
| 2.1.6.2 实验试剂的配制 | 第34-35页 |
| 2.1.7 实验引物 | 第35-39页 |
| 2.2 实验方法 | 第39-67页 |
| 2.2.1 有机磷农药通用结构半抗原的化学合成和鉴定 | 第39-41页 |
| 2.2.2 有机磷农药通用结构人工抗原的合成和鉴定 | 第41-42页 |
| 2.2.3 BALB/C小鼠的免疫 | 第42页 |
| 2.2.4 单克隆抗体的制备 | 第42-43页 |
| 2.2.4.1 细胞融合 | 第42-43页 |
| 2.2.4.2 单克隆抗体的制备 | 第43页 |
| 2.2.5 利用单克隆抗体和化学合成包被原建立异源IC-ELISA | 第43-44页 |
| 2.2.5.1 IC-ELISA步骤 | 第43页 |
| 2.2.5.2 最佳包被原的筛选 | 第43-44页 |
| 2.2.5.3 IC-ELISA工作缓冲液优化 | 第44页 |
| 2.2.6 利用单克隆抗体和化学合成包被原建立异源DC-ELISA方法 | 第44-45页 |
| 2.2.6.1 酶标单克隆抗体的制备 | 第44页 |
| 2.2.6.2 DC-ELISA步骤及优化 | 第44-45页 |
| 2.2.7 噬菌体抗体库的构建 | 第45-53页 |
| 2.2.7.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第45-46页 |
| 2.2.7.2 单链抗体基因扩增 | 第46-48页 |
| 2.2.7.3 pIT2-BAD噬粒的构建 | 第48-52页 |
| 2.2.7.4 噬菌体抗体库的构建 | 第52-53页 |
| 2.2.8 噬菌体抗体库的筛选 | 第53-55页 |
| 2.2.8.1 噬菌体抗体库的拯救 | 第53-54页 |
| 2.2.8.2 生物素化抗原的制备 | 第54页 |
| 2.2.8.3 噬菌体抗体库的淘选 | 第54页 |
| 2.2.8.4 Phage-ELISA对噬菌体抗体库及单克隆的筛选 | 第54-55页 |
| 2.2.9 生物素化单链抗体的制备 | 第55-58页 |
| 2.2.9.1 生物素连接酶的表达 | 第55-57页 |
| 2.2.9.2 单链抗体的原核表达 | 第57页 |
| 2.2.9.3 单链抗体的复性 | 第57页 |
| 2.2.9.4 单链抗体的生物素化、纯化及鉴定 | 第57-58页 |
| 2.2.10 利用生物素化单链抗体建立IC-ELISA | 第58页 |
| 2.2.10.1 单链抗体IC-ELISA步骤 | 第58页 |
| 2.2.10.2 单链抗体IC-ELISA条件优化 | 第58页 |
| 2.2.11 有机磷农药噬菌体模拟表位的筛选 | 第58-61页 |
| 2.2.11.1 噬菌体展示随机环七肽库的淘选 | 第59页 |
| 2.2.11.2 噬菌体的扩增与纯化 | 第59-60页 |
| 2.2.11.3 噬菌体滴度的测定 | 第60页 |
| 2.2.11.4 噬菌体单克隆的筛选及测序 | 第60-61页 |
| 2.2.12 噬菌体模拟表位原核表达 | 第61-63页 |
| 2.2.12.1 pET-28-BAD质粒的构建 | 第61-62页 |
| 2.2.12.2 模拟表位融合蛋白原核表达载体的构建 | 第62-63页 |
| 2.2.12.3 ME-GST-BAD融合蛋白的原核表达及体外生物素化 | 第63页 |
| 2.2.13 利用ME-GST-BAD融合蛋白建立DC-ELISA | 第63页 |
| 2.2.14 交叉反应和灵敏度的测定 | 第63-65页 |
| 2.2.15 QuEChERS样品前处理方法的优化 | 第65-66页 |
| 2.2.16 样品的农药添加回收实验 | 第66-67页 |
| 3 结果与分析 | 第67-116页 |
| 3.1 有机磷农药人工抗原的合成和鉴定 | 第67-75页 |
| 3.1.1 有机磷农药通用结构半抗原的鉴定 | 第67-71页 |
| 3.1.2 有机磷农药人工抗原的鉴定 | 第71-75页 |
| 3.2 Hapten1-BSA对应单克隆抗体的制备和异源ELISA检测方法的建立 | 第75-85页 |
| 3.2.1 BALB/C小鼠免疫效果检测 | 第75页 |
| 3.2.2 单克隆抗体的制备和筛选 | 第75-76页 |
| 3.2.3 最佳包被原的筛选 | 第76-77页 |
| 3.2.4 IC-ELISA工作缓冲液优化 | 第77-79页 |
| 3.2.5 交叉反应和灵敏度的测定 | 第79-80页 |
| 3.2.6 QuEChERS样品前处理方法的优化 | 第80-83页 |
| 3.2.7 样品的农药添加回收实验 | 第83-85页 |
| 3.3 Hapten2-BSA对应单克隆抗体的制备和异源ELISA检测方法的建立 | 第85-94页 |
| 3.3.1 BALB/C小鼠免疫效果检测 | 第85-86页 |
| 3.3.2 单克隆抗体的制备和筛选 | 第86页 |
| 3.3.3 最佳包被原的筛选 | 第86-88页 |
| 3.3.4 DC-ELISA工作缓冲液优化 | 第88-89页 |
| 3.3.5 交叉反应和灵敏度的测定 | 第89-92页 |
| 3.3.6 样品前处理 | 第92-93页 |
| 3.3.7 样品的农药添加回收实验 | 第93-94页 |
| 3.4 Hapten1-BSA对应单链抗体的制备和ELISA检测方法的建立 | 第94-105页 |
| 3.4.1 pIT2-BAD噬粒的构建 | 第94-95页 |
| 3.4.2 噬菌体抗体库的构建 | 第95-96页 |
| 3.4.3 噬菌体抗体库的淘选及单链抗体的筛选 | 第96-98页 |
| 3.4.4 单链抗体的表达、复性、生物素化及纯化 | 第98-101页 |
| 3.4.4.1 单链抗体的原核表达和复性 | 第98-99页 |
| 3.4.4.2 BirA的原核表达和单链抗体的生物素化 | 第99-100页 |
| 3.4.4.3 生物素化单链抗体的纯化和验证 | 第100-101页 |
| 3.4.5 基于生物素化单链抗体的IC-ELISA的建立 | 第101-104页 |
| 3.4.5.1 基于生物素化单链抗体的IC-ELISA的工作缓冲液的优化 | 第101-102页 |
| 3.4.5.2 交叉反应和灵敏度的测定 | 第102-104页 |
| 3.4.6 样品前处理 | 第104-105页 |
| 3.4.7 样品的农药添加回收实验 | 第105页 |
| 3.5 MAb3A7抗原模拟表位的筛选、表达及ELISA检测方法的建立 | 第105-111页 |
| 3.5.1 MAb3A7噬菌体抗原模拟表位的筛选 | 第105-106页 |
| 3.5.2 抗原模拟表位融合蛋白ME13-GST-BAD的表达、生物素化及纯化 | 第106-107页 |
| 3.5.3 基于ME13-GST-BAD的DC-ELISA的交叉反应和灵敏度的测定 | 第107-110页 |
| 3.5.4 样品前处理 | 第110页 |
| 3.5.5 样品的农药添加回收实验 | 第110-111页 |
| 3.6 MAb3C9抗原模拟表位的筛选、表达及ELISA检测方法的建立 | 第111-116页 |
| 3.6.1 MAb3C9噬菌体抗原模拟表位的筛选 | 第111-112页 |
| 3.6.2 抗原模拟表位融合蛋白ME20-GST-BAD的表达、生物素化及纯化 | 第112-113页 |
| 3.6.3 基于ME20-GST-BAD的DC-ELISA的交叉反应和灵敏度的测定 | 第113-114页 |
| 3.6.4 样品前处理 | 第114-115页 |
| 3.6.5 样品的农药添加回收实验 | 第115-116页 |
| 4 讨论 | 第116-122页 |
| 4.1 有机磷农药通用结构免疫半抗原的设计 | 第116-118页 |
| 4.2 基于有机磷农药宽谱特异性单克隆抗体的异源ELISA的建立 | 第118-119页 |
| 4.3 基于有机磷农药宽谱特异性单链抗体的异源ELISA的建立 | 第119-120页 |
| 4.4 基于单克隆抗体模拟表位的ELISA的建立 | 第120-121页 |
| 4.5 QuEChERS法用于免疫分析中样品的净化 | 第121-122页 |
| 5 结论 | 第122-123页 |
| 参考文献 | 第123-131页 |
| 致谢 | 第131-132页 |
| 攻读学位期间发表的论文及成果 | 第132页 |
