| 中文摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 引言 | 第9-20页 |
| 1.1 纤维素生产燃料乙醇 | 第9-14页 |
| 1.1.1 纤维素和纤维素酶 | 第9-13页 |
| 1.1.1.1 纤维素 | 第9-10页 |
| 1.1.1.2 纤维素酶 | 第10-11页 |
| 1.1.1.3 纤维素酶的分子结构 | 第11-12页 |
| 1.1.1.4 纤维素酶降解机理 | 第12页 |
| 1.1.1.5 纤维素酶的调节机制 | 第12-13页 |
| 1.1.2 纤维素酶分子生物学研究进展 | 第13-14页 |
| 1.1.3 纤维素燃料乙醇研究进展 | 第14页 |
| 1.2 丝状真菌里氏木霉表达系统研究进展 | 第14-19页 |
| 1.2.1 里氏木霉表达系统的优点 | 第14-15页 |
| 1.2.2 里氏木霉表达系统的组成 | 第15-17页 |
| 1.2.2.1 选择性标记 | 第15-16页 |
| 1.2.2.2 外源基因转化方法 | 第16页 |
| 1.2.2.3 外源基因的转化类型 | 第16-17页 |
| 1.2.3 提高异源蛋白表达产量的对策 | 第17-18页 |
| 1.2.3.1 强表达启动子 | 第17页 |
| 1.2.3.2 异源蛋白的表达与分泌 | 第17-18页 |
| 1.2.4 里氏木霉生产重组蛋白的应用 | 第18-19页 |
| 1.3 本课题研究的主要内容及其创新点 | 第19-20页 |
| 1.3.1 研究内容 | 第19页 |
| 1.3.2 创新点 | 第19-20页 |
| 第二章 材料与方法 | 第20-35页 |
| 2.1 材料 | 第20-25页 |
| 2.1.1 主要仪器 | 第20页 |
| 2.1.2 菌株、质粒 | 第20-21页 |
| 2.1.3 主要药品和试剂 | 第21页 |
| 2.1.4 培养基 | 第21-22页 |
| 2.1.5 常用缓冲液和溶液 | 第22-23页 |
| 2.1.6 PCR 引物 | 第23-25页 |
| 2.2 方法 | 第25-35页 |
| 2.2.1 纤维素酶产生菌的筛选 | 第25-26页 |
| 2.2.1.1 富集 | 第25页 |
| 2.2.1.2 初筛 | 第25页 |
| 2.2.1.3 纯化保种 | 第25页 |
| 2.2.1.4 复筛 | 第25页 |
| 2.2.1.5 发酵及酶活测定 | 第25-26页 |
| 2.2.2 菌株鉴定 | 第26-28页 |
| 2.2.2.1 菌落形态观察及镜检 | 第26-27页 |
| 2.2.2.2 ITS 序列分析 | 第27-28页 |
| 2.2.3 纤维素酶基因的克隆 | 第28-30页 |
| 2.2.3.1 PCR 扩增 | 第28页 |
| 2.2.3.2 与 T 载体连接 | 第28-29页 |
| 2.2.3.3 感受态细胞的制备及连接产物的转化 | 第29-30页 |
| 2.2.3.4 质粒提取 | 第30页 |
| 2.2.3.5 重组质粒 PCR 验证 | 第30页 |
| 2.2.3.6 测序及序列分析 | 第30页 |
| 2.2.4 外源基因表达载体的构建 | 第30-33页 |
| 2.2.4.1 PCR 反应体系及反应条件 | 第30-31页 |
| 2.2.4.2 酶切体系 | 第31-32页 |
| 2.2.4.3 酶连体系 | 第32-33页 |
| 2.2.5 重组表达载体的构建及转化 | 第33-35页 |
| 2.2.5.1 酶切体系 | 第33页 |
| 2.2.5.2 酶连体系 | 第33页 |
| 2.2.5.3 原生质体的制备 | 第33-34页 |
| 2.2.5.4 重组质粒转化 | 第34页 |
| 2.2.5.5 转化子的筛选与验证 | 第34-35页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第35-59页 |
| 3.1 纤维素酶产生菌的筛选 | 第35-40页 |
| 3.1.1 筛选结果 | 第35页 |
| 3.1.2 发酵及酶活测定 | 第35-37页 |
| 3.1.2.1 葡萄糖标准曲线绘制 | 第35-36页 |
| 3.1.2.2 酶活测定 | 第36-37页 |
| 3.1.3 菌株鉴定 | 第37-40页 |
| 3.1.3.1 菌落形态观察及镜检 | 第37-38页 |
| 3.1.3.2 ITS 序列分析结果 | 第38-40页 |
| 3.2 纤维素酶基因的克隆 | 第40-46页 |
| 3.2.1 纤维素酶基因的 PCR 扩增 | 第40页 |
| 3.2.2 纤维素酶基因连接 T 载体 | 第40-41页 |
| 3.2.3 序列分析 | 第41-46页 |
| 3.3 里氏木霉外源基因表达载体的构建 | 第46-55页 |
| 3.3.1 基因的扩增 | 第47-49页 |
| 3.3.1.1 cbh1 启动子的扩增 | 第47-48页 |
| 3.3.1.2 cbh1 终止子的扩增 | 第48页 |
| 3.3.1.3 G418 抗性基因的扩增 | 第48-49页 |
| 3.3.2 质粒 pUC19 插入 cbh1 启动子 | 第49-50页 |
| 3.3.2.1 转化子质粒提取 | 第49页 |
| 3.3.2.2 PCR 及双酶切验证 | 第49-50页 |
| 3.3.3 重组质粒 pUC19-P 插入 cbh1 终止子 | 第50-52页 |
| 3.3.3.1 转化子质粒提取 | 第50-51页 |
| 3.3.3.2 PCR 及双酶切验证 | 第51-52页 |
| 3.3.4 重组质粒 pUC19-PT 插入多克隆序列 | 第52-53页 |
| 3.3.4.1 转化子质粒提取 | 第52页 |
| 3.3.4.2 PCR 及双酶切验证 | 第52-53页 |
| 3.3.5 重组质粒 pUC19-PTM 插入 G418 抗性基因 | 第53-55页 |
| 3.3.5.1 转化子质粒提取 | 第53-54页 |
| 3.3.5.2 PCR 及双酶切验证 | 第54-55页 |
| 3.4 重组表达载体的构建及转化 | 第55-59页 |
| 3.4.1 重组质粒 pUC19-PTMB 的构建 | 第55-57页 |
| 3.4.1.1 转化子质粒提取 | 第55-56页 |
| 3.4.1.2 PCR 及双酶切验证 | 第56-57页 |
| 3.4.2 原生质体的制备及转化 | 第57-58页 |
| 3.4.3 转化子的筛选与验证 | 第58-59页 |
| 结论与建议 | 第59-61页 |
| 结论 | 第59-60页 |
| 建议 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 个人简历 | 第66页 |
