| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略词 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-23页 |
| 1.1 农杆菌介导的水稻遗传转化 | 第12页 |
| 1.2 AtVIP1的研究进展 | 第12-15页 |
| 1.2.1 AtVIP1的发现 | 第12-13页 |
| 1.2.2 AtVIP1的结构特征 | 第13页 |
| 1.2.3 AtVIP1在T-复合物进入细胞核中的作用 | 第13-14页 |
| 1.2.4 AtVIP1在T-复合物在细胞核内转移过程中的作用 | 第14页 |
| 1.2.5 AtVIP1在T-DNA进行基因组整合过程中的作用 | 第14页 |
| 1.2.6 AtVIP1参与植物的免疫应答反应并调控相关防御基因表达 | 第14-15页 |
| 1.2.7 问题和展望 | 第15页 |
| 1.3 植物基因功能的研究方法 | 第15-22页 |
| 1.3.1 RNAi技术研究进展 | 第16-20页 |
| 1.3.1.1 RNAi的发现 | 第16页 |
| 1.3.1.2 RNAi的作用机制 | 第16-19页 |
| 1.3.1.3 RNAi技术的特点 | 第19页 |
| 1.3.1.4 RNAi在植物功能基因组研究中的作用 | 第19-20页 |
| 1.3.2 酵母双杂交技术研究进展 | 第20-21页 |
| 1.3.4 超表达(Over-expression) | 第21-22页 |
| 1.4 研究目的和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 OsVIP1基因的RNAi载体构建及水稻转化 | 第23-41页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 实验材料和方法 | 第23-32页 |
| 2.2.1 水稻遗传转化受体 | 第23页 |
| 2.2.2 菌株 | 第23页 |
| 2.2.3 载体 | 第23页 |
| 2.2.4 主要试剂 | 第23-24页 |
| 2.2.5 本实验所用引物 | 第24页 |
| 2.2.6 构建OsVIP1基因的RNAi载体片段的获得 | 第24-26页 |
| 2.2.6.1 OsVIP1片段的获得 | 第24页 |
| 2.2.6.2 OsVIP1 RNAi特异性片段的选择和引物设计 | 第24-25页 |
| 2.2.6.3 OsVIP1 RNAi特异性片段的PCR扩增,纯化 | 第25-26页 |
| 2.2.7 OsVIP1 RNAi载体构建 | 第26-27页 |
| 2.2.7.1 片段R1和R2与pGEM-T-Easy载体的连接 | 第26页 |
| 2.2.7.2 片段R1和R2与RNAi载体的正方向连接 | 第26-27页 |
| 2.2.7.3 片段R1和R2与RNAi载体的反方向连接 | 第27页 |
| 2.2.8 RNAi载体转化根癌农杆菌EHA105 | 第27页 |
| 2.2.9 根癌农杆菌EHA105介导的水稻遗传转化 | 第27-29页 |
| 2.2.9.1 农杆菌的培养 | 第27-28页 |
| 2.2.9.2 水稻粳稻品种中花11愈伤的诱导 | 第28页 |
| 2.2.9.3 水稻粳稻品种中花11愈伤的诱导继代 | 第28页 |
| 2.2.9.4 农杆菌EHA105悬浮培养准备 | 第28页 |
| 2.2.9.5 农杆菌侵染与共培养 | 第28-29页 |
| 2.2.9.6 水洗和第一次筛选,第二次筛选 | 第29页 |
| 2.2.9.7 抗性愈伤的分化 | 第29页 |
| 2.2.9.8 分化的再生植株生根 | 第29页 |
| 2.2.9.9 炼苗和移栽 | 第29页 |
| 2.2.10 RNAi载体转化中花11愈伤检测 | 第29-30页 |
| 2.2.10.1 RNAi转基因水稻中花11抗性愈伤统计 | 第29-30页 |
| 2.2.11 RNAi转基因植株的检测 | 第30-32页 |
| 2.2.11.1 PCR鉴定T0代转基因植株阳性苗 | 第30-31页 |
| 2.2.11.2 RT-PCR法检测T0代转基因植株中目标基因表达量的变化 | 第31-32页 |
| 2.3 结果与分析 | 第32-39页 |
| 2.3.1 RNAi载体的构建 | 第32-35页 |
| 2.3.1.1 水稻中VIP1蛋白(OsVIP1)与拟南芥VIP1蛋白(AtVIP1)的同源性比对 | 第32-33页 |
| 2.3.1.2 OsVIP1 RNAi特异性片段R1和R2的克隆 | 第33-34页 |
| 2.3.1.3 R1和R2片段RNAi载体的构建 | 第34-35页 |
| 2.3.2 RNAi载体转化中花11愈伤转化效率的检测 | 第35-36页 |
| 2.3.2.1 RNAi转基因水稻中花11抗性愈伤统计 | 第35-36页 |
| 2.3.3 RNAi转基因植株的检测 | 第36-39页 |
| 2.3.3.1 T0代转基因植株筛选标记潮霉素检测 | 第36-37页 |
| 2.3.3.2 RT-PCR法检测T0代转基因植株OsVIP1和PBZI基因表达量 | 第37-39页 |
| 2.4 讨论 | 第39-41页 |
| 2.4.1 OsVIP1可能参与农杆菌介导的水稻遗传转化过程 | 第39-40页 |
| 2.4.2 防卫基因PBZI可能和OsVIP1基因存在着密切关系 | 第40-41页 |
| 第三章 水稻中与VIRE2相互作用的蛋白的筛选 | 第41-51页 |
| 3.1 前言 | 第41页 |
| 3.2 实验材料和方法 | 第41-45页 |
| 3.2.1 菌株 | 第41页 |
| 3.2.2 载体 | 第41页 |
| 3.2.3 本实验中所用到的引物 | 第41-42页 |
| 3.2.4 主要试剂 | 第42页 |
| 3.2.5 BD-VirE2载体的构建 | 第42页 |
| 3.2.5.1 EHA105中的毒性蛋白VirE2序列 | 第42页 |
| 3.2.5.2 VirE2基因PCR产物回收与pGEM-T-Easy载体连接 | 第42页 |
| 3.2.5.3 VirE2与pGBKT7载体连接 | 第42页 |
| 3.2.6 BD-VirE2转化酵母Y187 | 第42-43页 |
| 3.2.7 BD-VirE2自激活检测 | 第43页 |
| 3.2.8 用BD-VirE2筛选日本晴叶片cDNA酵母双杂交文库--Mating | 第43页 |
| 3.2.9 BD-VirE2筛选日本晴cDNA酵母双杂交文库所得克隆的检测 | 第43-45页 |
| 3.2.9.1 PCR检测pGADT7载体中插入片段的片段大小 | 第43-44页 |
| 3.2.9.2 PCR产物测序和序列比对 | 第44-45页 |
| 3.2.10. 对候选克隆的进一步验证 | 第45页 |
| 3.2.10.1 在X-α-Gal的四缺皿上显色 | 第45页 |
| 3.2.10.2 候选阳性克隆验证 | 第45页 |
| 3.3 结果与分析 | 第45-49页 |
| 3.3.1 BD-VirE2载体的构建 | 第45-46页 |
| 3.3.2 BD-VirE2自激活检测 | 第46-47页 |
| 3.3.3 BD-VirE2筛选日本晴cDNA酵母双杂交文库所得克隆的检测 | 第47-48页 |
| 3.3.3.1 PCR检测pGADT7载体中插入片段的片段大小 | 第47-48页 |
| 3.3.3.2 阳性酵母克隆PCR片段测序和序列比对 | 第48页 |
| 3.3.4 候选克隆的进一步检测 | 第48-49页 |
| 3.3.4.1 候选克隆Y-OsGH3和Y-OsAOR显色实验 | 第48-49页 |
| 3.3.4.2 候选阳性克隆验证 | 第49页 |
| 3.4 讨论 | 第49-51页 |
| 3.4.1 关于VirE2筛选日本晴cDNA酵母双杂交文库的实验结果 | 第49-50页 |
| 3.4.2 关于VirE2筛选日本晴cDNA酵母双杂交文库实验的一些思考 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-56页 |
| 附录1 粳稻转化培养基配方 | 第56-60页 |
| 附录2 反转录实验步骤 | 第60页 |
| 附录3 农杆菌EHA105感受态细胞制备 | 第60-61页 |
| 附录4 酵母细胞感受态的制备和酵母转化 | 第61-62页 |
| 附录5 酵母细胞Y187筛选CDNA文库的操作步骤 | 第62-63页 |
| 致谢 | 第63页 |
