| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 第一部分 绪论 | 第13-23页 |
| 1.1 基因的编辑技术 | 第13-14页 |
| 1.2 CRISPR/Cas系统 | 第14-22页 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas系统研究历史 | 第14-15页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas系统位点的结构 | 第15-16页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas系统分类及作用机制 | 第16-17页 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas9 | 第17-22页 |
| 1.3 研究课题的意义 | 第22-23页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第23-41页 |
| 2.1 实验材料和仪器设备 | 第23-30页 |
| 2.1.1 实验菌株 | 第23页 |
| 2.1.2 培养基 | 第23页 |
| 2.1.3 质粒 | 第23-24页 |
| 2.1.4 引物 | 第24-28页 |
| 2.1.5 酶和试剂 | 第28页 |
| 2.1.6 仪器和设备 | 第28-29页 |
| 2.1.7 主要缓冲液 | 第29-30页 |
| 2.2 实验方法与步骤 | 第30-41页 |
| 2.2.1 用碱裂解法抽提质粒DNA | 第30页 |
| 2.2.2 酵母总DNA的抽提 | 第30页 |
| 2.2.3 PCR产物或者酶切产物DNA片段回收 | 第30-31页 |
| 2.2.4 凝胶回收目的DNA片段 | 第31页 |
| 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第31页 |
| 2.2.6 大肠杆菌的转化 | 第31-32页 |
| 2.2.7 菌落PCR验证重组子的方法 | 第32页 |
| 2.2.8 毕赤酵母表达载体的构建与验证 | 第32页 |
| 2.2.9 毕赤酵母感受态的制备 | 第32页 |
| 2.2.10 毕赤酵母的转化 | 第32-33页 |
| 2.2.11 SDS-PAGE检测表达蛋白 | 第33页 |
| 2.2.12 重组毕赤酵母的诱导表达 | 第33-34页 |
| 2.2.13 枯草芽孢杆菌SCK6感受态的制备和转化 | 第34页 |
| 2.2.14 枯草芽孢杆菌作为宿主表达蛋白 | 第34页 |
| 2.2.15 Western Blot操作步骤 | 第34-36页 |
| 2.2.16 枯草芽孢杆菌总RNA提取 | 第36页 |
| 2.2.17 cDNA第一条链合成 | 第36-37页 |
| 2.2.18 荧光实时定量PCR | 第37-38页 |
| 2.2.19 荧光值的测定 | 第38页 |
| 2.2.20 枯草芽孢杆菌SCK6发酵上清淀粉酶活性测定 | 第38-41页 |
| 第三部分 结果与分析 | 第41-56页 |
| 3.1 CRISPR/Cas9系统在毕赤酵母基因编辑中的应用 | 第41-46页 |
| 3.1.1 毕赤酵母中Cas9蛋白表达载体的构建 | 第41页 |
| 3.1.2 质粒pPICZ-SpCas9转化毕赤酵母及转化子验证 | 第41-42页 |
| 3.1.3 酵母转化子诱导表达Cas9蛋白 | 第42-43页 |
| 3.1.4 sgRNA表达单元的构建及靶位点的选择 | 第43-45页 |
| 3.1.5 检测CRISPR/Cas9系统在毕赤酵母中的切割DNA效率 | 第45页 |
| 3.1.6 检测CRISPR/Cas9系统在毕赤酵母中通过HR修复效率 | 第45-46页 |
| 3.2 CRISPRi技术在枯草芽孢杆菌杆菌中的研究 | 第46-56页 |
| 3.2.1 dCas9蛋白的表达载体的构建 | 第46页 |
| 3.2.2 质粒pHT01-dCas9的转化和验证 | 第46-47页 |
| 3.2.3 枯草芽孢杆菌诱导表达dCas9蛋白 | 第47-48页 |
| 3.2.4 dCas9蛋白的表达对菌株的生长的影响 | 第48-49页 |
| 3.2.5 构建sgRNA表达质粒 | 第49-50页 |
| 3.2.6 应用CRISPRi技术对外源基因GFP的干扰效应 | 第50-53页 |
| 3.2.7 应用CRISPRi技术对内源基因amy的干扰效应 | 第53-56页 |
| 第四部分 讨论与展望 | 第56-60页 |
| 4.1 CRISPR/Cas9技术在毕赤酵母中研究 | 第56-57页 |
| 4.2 CRISPRi技术在枯草芽孢杆菌中研究 | 第57-60页 |
| 参考文献 | 第60-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
