| 摘要 | 第7-10页 |
| ABSTRACT | 第10-13页 |
| 符号说明 | 第14-15页 |
| 第一部分 转录调控蛋白FleQ REC结构域的结构与功能研究 | 第15-107页 |
| 第一章 前言 | 第15-39页 |
| 1.1 铜绿假单胞菌概述 | 第15-17页 |
| 1.2 铜绿假单胞菌的鞭毛合成及调控 | 第17-22页 |
| 1.2.1 铜绿假单胞菌的运动性 | 第17-18页 |
| 1.2.2 铜绿假单胞菌鞭毛的四级调控系统 | 第18-21页 |
| 1.2.3 铜绿假单胞菌的鞭毛与致病性 | 第21-22页 |
| 1.3 铜绿假单胞菌的生物被膜形成及调控 | 第22-34页 |
| 1.3.1 生物被膜的形成 | 第22-25页 |
| 1.3.2 生物被膜的调控及信号转导系统 | 第25-28页 |
| 1.3.3 C-di-GMP调控系统 | 第28-31页 |
| 1.3.4 C-di-GMP的信号转导机制 | 第31-34页 |
| 1.4 FleQ研究进展 | 第34-37页 |
| 1.4.1 FleQ与细菌运动性 | 第34-35页 |
| 1.4.2 FleQ与生物膜 | 第35-37页 |
| 1.5 课题的研究意义与内容 | 第37-39页 |
| 1.5.1 课题的研究意义 | 第37-38页 |
| 1.5.2 课题的研究内容 | 第38-39页 |
| 第二章 FleQ蛋白的表达、纯化和结晶 | 第39-63页 |
| 2.1 引言 | 第39-40页 |
| 2.2 实验材料 | 第40-42页 |
| 2.2.1 菌株、基因组和载体 | 第40页 |
| 2.2.2 试剂、工具酶和服务 | 第40-41页 |
| 2.2.3 主要仪器设备 | 第41页 |
| 2.2.4 蛋白纯化缓冲液的配置 | 第41-42页 |
| 2.3 实验方法 | 第42-49页 |
| 2.3.1 原核表达载体的构建 | 第42-46页 |
| 2.3.2 蛋白表达和纯化 | 第46-48页 |
| 2.3.3 硒代甲硫氨酸(Se-Met)蛋白衍生物的制备 | 第48-49页 |
| 2.4 实验结果 | 第49-58页 |
| 2.4.1 FleQ全长蛋白的分离纯化 | 第49-54页 |
| 2.4.2 FleQ REC结构域的分离纯化 | 第54-56页 |
| 2.4.3 FleQ REC结构域Se-Met蛋白的分离纯化 | 第56-58页 |
| 2.5 蛋白晶体的筛选与优化 | 第58-61页 |
| 2.5.1 结晶所需的材料与方法 | 第58-60页 |
| 2.5.2 FleQ全长蛋白的晶体筛选与优化 | 第60页 |
| 2.5.3 FleQ REC结构域的晶体筛选与优化 | 第60-61页 |
| 2.5.4 FleQ REC结构域Se-Met晶体的筛选与优化 | 第61页 |
| 2.6 本章小结 | 第61-63页 |
| 第三章 FleQ REC结构域的结构解析 | 第63-69页 |
| 3.1 基本原理 | 第63-65页 |
| 3.1.1 X射线衍射基本原理 | 第63页 |
| 3.1.2 相位的确定 | 第63-65页 |
| 3.2 实验方法 | 第65-66页 |
| 3.2.1 衍射数据收集和处理 | 第65页 |
| 3.2.2 相位求解和模型搭建 | 第65页 |
| 3.2.3 结构模型的修正 | 第65-66页 |
| 3.3 实验结果 | 第66-67页 |
| 3.3.1 衍射数据的处理结果 | 第66-67页 |
| 3.3.2 结构精修结果 | 第67页 |
| 3.4 本章小结 | 第67-69页 |
| 第四章 FleQ REC结构域的结构分析与功能研究 | 第69-107页 |
| 4.1 引言 | 第69页 |
| 4.2 实验材料 | 第69-70页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第69页 |
| 4.2.2 试剂和耗材 | 第69-70页 |
| 4.2.3 仪器设备 | 第70页 |
| 4.3 实验方法 | 第70-83页 |
| 4.3.1 铜绿假单胞菌的基因敲除与回补 | 第70-75页 |
| 4.3.2 表型实验 | 第75-76页 |
| 4.3.3 突变体的构建 | 第76-78页 |
| 4.3.4 荧光定量PCR检测基因转录水平 | 第78-79页 |
| 4.3.5 圆二色谱(Circular dichroism spectroscopy)检测蛋白性状 | 第79-80页 |
| 4.3.6 ATPase活性测性 | 第80-81页 |
| 4.3.7 等温滴定量热法(ITC) | 第81-83页 |
| 4.4 实验结果 | 第83-105页 |
| 4.4.1 fleQ的基因敲除与回补 | 第83-85页 |
| 4.4.2 REC结构域对FleQ发挥功能必不可少 | 第85-88页 |
| 4.4.3 FleQ REC结构域的晶体结构 | 第88-91页 |
| 4.4.4 FleQ REC结构域的二聚化 | 第91-94页 |
| 4.4.5 螺旋α1介导的二聚化在FleQ功能中起到关键作用 | 第94-97页 |
| 4.4.6 REC结构域的二体突变影响鞭毛及EPS基因的转录 | 第97-100页 |
| 4.4.7 C-di-GMP结合位点的鉴定 | 第100-105页 |
| 4.5 本章小结 | 第105-107页 |
| 第二部分 糖苷水解酶PslG的结构与功能研究 | 第107-127页 |
| 第一章 前言 | 第107-111页 |
| 第二章 PslG的纯化、结晶和结构解析 | 第111-116页 |
| 2.1 PslG的克隆和纯化 | 第111-113页 |
| 2.2 PslG的结晶及结构解析 | 第113-116页 |
| 2.2.1 PslG的结晶 | 第113-114页 |
| 2.2.2 PslG的结构解析 | 第114-116页 |
| 第三章 结构分析和功能研究 | 第116-126页 |
| 3.1 PslG的晶体结构 | 第116-117页 |
| 3.2 催化结构域 | 第117-119页 |
| 3.3 CBM结构域 | 第119-120页 |
| 3.4 可能的水解机制 | 第120-126页 |
| 第四章 小结 | 第126-127页 |
| 全文总结 | 第127-130页 |
| 参考文献 | 第130-142页 |
| 攻读博士学位期间发表论文 | 第142页 |
| 参加学术会议情况 | 第142-143页 |
| 致谢 | 第143-144页 |
| 附件 | 第144-145页 |
| 附录 | 第145-157页 |
