| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 前言 | 第12-19页 |
| 1.1 兰花病害概述 | 第12-13页 |
| 1.2 建兰花叶病毒 | 第13-17页 |
| 1.2.1 建兰花叶病毒引致的兰花症状 | 第13页 |
| 1.2.2 广东建兰花叶病毒研究进展 | 第13-14页 |
| 1.2.3 建兰花叶病毒的基因组结构 | 第14页 |
| 1.2.4 建兰花叶病毒的遗传多样性 | 第14-15页 |
| 1.2.5 建兰花叶病毒检测方法 | 第15-17页 |
| 1.3 侵染性克隆研究 | 第17-19页 |
| 1.4 研究目的意义 | 第19页 |
| 2 材料与方法 | 第19-37页 |
| 2.1 材料 | 第19-22页 |
| 2.1.1 植物材料及病毒来源 | 第19页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第19-20页 |
| 2.1.3 菌种及载体 | 第20页 |
| 2.1.4 主要仪器及设备 | 第20-21页 |
| 2.1.5 主要试剂的配制 | 第21-22页 |
| 2.2 广东建兰花叶分离物的遗传多样性分析 | 第22-31页 |
| 2.2.1 RNA提取用具的处理 | 第22页 |
| 2.2.2 总RNA的提取 | 第22-23页 |
| 2.2.3 RT-PCR扩增的引物 | 第23-24页 |
| 2.2.4 RT-PCR分段扩增Cym MV全长和CP序列 | 第24-25页 |
| 2.2.5 RT-PCR产物的回收 | 第25页 |
| 2.2.6 目的片段的TA克隆 | 第25-26页 |
| 2.2.7 大肠杆菌JM109感受态的制备 | 第26页 |
| 2.2.8 重组质粒的转化 | 第26-27页 |
| 2.2.9 重组质粒的抽提 | 第27页 |
| 2.2.10 重组质粒的双酶切及序列测定 | 第27-28页 |
| 2.2.11 序列分析 | 第28-31页 |
| 2.3 建兰花叶病毒侵染性克隆构建 | 第31-35页 |
| 2.3.1 植物双元表达载体pCAMBIA2300-35S改造 | 第31-32页 |
| 2.3.2 两个目的片段分别连接到pCAMBIA2300-JT | 第32-33页 |
| 2.3.3 农杆菌GV3101菌株感受态细胞的制备 | 第33页 |
| 2.3.4 电击转化 | 第33-34页 |
| 2.3.5 农杆菌介导的植物接种 | 第34页 |
| 2.3.6 侵染性克隆检测接种本生烟发病情况 | 第34-35页 |
| 2.3.6.1 RT-PCR检测 | 第34页 |
| 2.3.6.2 ELISA检测 | 第34-35页 |
| 2.4 瞬时表达 | 第35-37页 |
| 2.4.1 三个分离物全长表达载体的构建 | 第35-36页 |
| 2.4.2 PCR扩增获得pCAMBIA1302上GFP到Nos间 1037 bp目的条带 | 第36页 |
| 2.4.3 农杆菌介导的植物接种 | 第36页 |
| 2.4.4 观察接种后烟草GFP荧光变化情况 | 第36-37页 |
| 3 结果与分析 | 第37-64页 |
| 3.1 Cym MV广东分离物的遗传多样性分析 | 第37-55页 |
| 3.1.1 RT-PCR分别获得Cym MV分离物两个目的片段 | 第37页 |
| 3.1.2 Cym MV分离物目的片段的克隆及重组质粒鉴定 | 第37-38页 |
| 3.1.3 Cym MV序列分析 | 第38-55页 |
| 3.1.3.1 全基因组的结构特征和序列分析 | 第38-40页 |
| 3.1.3.2 Cym MV全基因组序列相似性和进化树分析 | 第40-42页 |
| 3.1.3.3 Cym MV CP序列相似性和进化树分析 | 第42-45页 |
| 3.1.3.3 Cym MV RdRp序列相似性和进化树分析 | 第45-47页 |
| 3.1.3.4 Cym MV TGB1序列相似性和进化树分析 | 第47-50页 |
| 3.1.3.5 Cym MV TGB2序列相似性和进化树分析 | 第50-52页 |
| 3.1.3.6 Cym MV TGB3序列相似性和进化树分析 | 第52-55页 |
| 3.2 侵染性克隆构建 | 第55-59页 |
| 3.2.1 植物双元表达载体pCAMBIA2300-35S改造 | 第55页 |
| 3.2.2 Cym MV分段连接到pCAMBIA2300-JT | 第55-56页 |
| 3.2.3 Cym MV全长重组质粒转化农杆菌GV3101 | 第56-57页 |
| 3.2.4 侵染性克隆检测接种本生烟发病情况 | 第57-59页 |
| 3.3 瞬时表达 | 第59-64页 |
| 3.3.1 Cym MV分离物全长表达载体的构建 | 第59-60页 |
| 3.3.2 Cym MV分离物全长瞬时表达观察病毒在本生烟的移动 | 第60-61页 |
| 3.3.3 Cym MV分离物全长瞬时表达荧光观察 | 第61-63页 |
| 3.3.4 Cym MV分离物全长与GFP序列连接侵染烟草症状观察 | 第63页 |
| 3.3.5 Cym MV分离物全长与GFP序列连接侵染烟草RT-PCR验证 | 第63-64页 |
| 4 结论与讨论 | 第64-69页 |
| 4.1 Cym MV遗传多样性分析 | 第64-66页 |
| 4.2 建兰花叶病毒侵染性克隆构建 | 第66-68页 |
| 4.3 结论 | 第68页 |
| 4.4 进一步需要解决的问题 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-76页 |
| 附录 | 第76-86页 |
