| 摘要 | 第7-8页 |
| 1.文献综述 | 第8-18页 |
| 1.1 基因组编辑 | 第8-15页 |
| 1.1.1 ZFNs技术 | 第8-10页 |
| 1.1.2 TALEN技术 | 第10-11页 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas技术 | 第11-15页 |
| 1.1.3.1 CRISPR/Cas技术简介 | 第11页 |
| 1.1.3.2 CRISPR/Cas9系统研究历史 | 第11页 |
| 1.1.3.3 CRISPR/Cas系统组成 | 第11-12页 |
| 1.1.3.4 CRISPR/Cas的分类 | 第12页 |
| 1.1.3.5 CRISPR/Cas Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型系统的作用机理 | 第12-13页 |
| 1.1.3.6 CRISPR/Cas9系统的作用过程 | 第13-14页 |
| 1.1.3.7 CRISPR/Cas9系统的应用 | 第14页 |
| 1.1.3.8 CRISPR/Cas系统的利弊 | 第14-15页 |
| 1.2 鸡体内糖营养转运蛋白及其转录调控因子 | 第15-17页 |
| 1.2.1 糖类转运蛋白GLUT2 | 第15-16页 |
| 1.2.2 转录调控因子 | 第16-17页 |
| 1.2.2.1 转录因子GATA2 | 第16页 |
| 1.2.2.2 转录因子USF1 | 第16-17页 |
| 1.3 本研究的目的、内容和意义 | 第17-18页 |
| 2.材料与方法 | 第18-36页 |
| 2.1 试验材料 | 第18-21页 |
| 2.1.1 试验动物 | 第18页 |
| 2.1.2 试验仪器设备 | 第18-19页 |
| 2.1.3 主要试验试剂 | 第19页 |
| 2.1.4 常用试剂的配制 | 第19-20页 |
| 2.1.5 引物设计及其他分析软件 | 第20页 |
| 2.1.6 细胞系与质粒 | 第20-21页 |
| 2.2 试验方法 | 第21-36页 |
| 2.2.1 生物信息学分析 | 第21-22页 |
| 2.2.2 构建Cas9打靶载体 | 第22-29页 |
| 2.2.2.1 设计识别靶点的sgRNA | 第22页 |
| 2.2.2.2 sgRNA两条单链的合成 | 第22-23页 |
| 2.2.2.3 两条单链sgRNA退火成双链及磷酸化处理 | 第23-24页 |
| 2.2.2.4 双链sRNA与px458载体连接 | 第24-28页 |
| 2.2.2.5 px458-sgRNA重组质粒的提取 | 第28-29页 |
| 2.2.3 CEF细胞的分离培养 | 第29-33页 |
| 2.2.3.1 鸡胚体的前处理 | 第29-30页 |
| 2.2.3.2 组织块培养法 | 第30页 |
| 2.2.3.3 胰蛋白酶消化法 | 第30-31页 |
| 2.2.3.4 鸡小肠来源的成纤维细胞的制备 | 第31页 |
| 2.2.3.5 次代CEF的制备 | 第31-32页 |
| 2.2.3.6 CEF细胞的冷冻保存与复苏 | 第32页 |
| 2.2.3.7 鸡CEF形态学性状检测 | 第32-33页 |
| 2.2.4 测定基因GLUT2在原代CEF细胞中的初始表达量 | 第33-35页 |
| 2.2.4.1 鸡CEF细胞RNA的提取 | 第33-34页 |
| 2.2.4.2 将所提RNA反转录成cDNA | 第34页 |
| 2.2.4.3 测定cDNA的初始表达量 | 第34-35页 |
| 2.2.4.4 表达量的数据处理 | 第35页 |
| 2.2.5 px458-sgRNA(GLUT2)表达载体转染细胞 | 第35-36页 |
| 3.试验结果 | 第36-48页 |
| 3.1 生物信息学分析结果 | 第36页 |
| 3.2 构建px458-sgRNA(GLUT2)打靶载体 | 第36-40页 |
| 3.2.1 sgRNA双链的形成 | 第37页 |
| 3.2.2 线性化原载体px458 | 第37-38页 |
| 3.2.3 PCR鉴别阳性重载体 | 第38-39页 |
| 3.2.4 DNA测序鉴定px458-GLUT2打靶载体 | 第39-40页 |
| 3.3 分离培养原代鸡CEF | 第40-46页 |
| 3.3.1 组织块培养法 | 第40-41页 |
| 3.3.2 胰蛋白酶消化法 | 第41页 |
| 3.3.3 不同来源鸡胚培养的原代CEF的形态观察 | 第41-42页 |
| 3.3.4 次代CEF细胞的形态学观察 | 第42-43页 |
| 3.3.5 原代、次代CEF细胞生长曲线的测定 | 第43-45页 |
| 3.3.6 成纤维细胞的形态学鉴定 | 第45-46页 |
| 3.4 测定基因GLUT2在原代CEF细胞中的初始表达量 | 第46-47页 |
| 3.4.1 RNA提取结果 | 第46页 |
| 3.4.2 GLUT2基因在CEF中的表达量 | 第46-47页 |
| 3.5 px458-sgRNA(GLUT2)打靶载体转染细胞 | 第47-48页 |
| 4.讨论 | 第48-50页 |
| 4.1 Cas9靶点选取 | 第48页 |
| 4.2 影响体外分离培养CEF的主要因素 | 第48-50页 |
| 5.结论 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-55页 |
| Abstract | 第55页 |
| 附录 | 第57-59页 |
| 致谢 | 第59页 |
