| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-12页 |
| 英文缩略表 | 第12-13页 |
| 引言 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-22页 |
| 口蹄疫病毒分子生物学的研究进展 | 第14-21页 |
| 1 口蹄疫病毒的流行特点 | 第14-15页 |
| 2 口蹄疫病的疫苗研究 | 第15-17页 |
| 3 口蹄疫病毒的分子生物学特征 | 第17-18页 |
| 4 口蹄疫病毒基因组结构 | 第18-21页 |
| 研究目的及意义 | 第21-22页 |
| 第二章 试验研究 | 第22-52页 |
| 试验一 口蹄疫病毒 2B、3A基因真核表达载体的构建及表达 | 第22-32页 |
| 摘要 | 第22页 |
| 1.材料 | 第22-23页 |
| ·毒株和质粒 | 第22页 |
| ·主要试剂 | 第22-23页 |
| ·仪器 | 第23页 |
| 2 方法 | 第23-27页 |
| ·引物的合成 | 第23页 |
| ·模板的制备 | 第23页 |
| ·目的基因的PCR的扩增 | 第23-24页 |
| ·目的片段的回收 | 第24页 |
| ·p MD-19-T-2B、p MD-19-T-3A重组质粒的构建 | 第24页 |
| ·转化连接产物 | 第24-25页 |
| ·重组质粒p MD-19-T-2B、p MD-19-T-3A的菌液PCR以及双酶切鉴定 | 第25页 |
| ·p MD-19-T-2B、p MD-19-T-3A质粒的PCR及双酶切验证 | 第25页 |
| ·p EGFP-N1-3A、p EGFP-N1-2B真核重组质粒的构建过程 | 第25-26页 |
| ·p EGFP-N1-3A、p EGFP-N1-2B的PCR验证及质粒双酶切鉴定 | 第26页 |
| ·大提质粒 | 第26页 |
| ·培养BHK细胞 | 第26页 |
| ·重组质粒转染BHK细胞 | 第26页 |
| ·细胞转染的具体过程 | 第26-27页 |
| 3 结果与分析 | 第27-30页 |
| ·目的基因 3A、2B的扩增 | 第27页 |
| ·p MD-18-T-3A、p MD-18-T-2B基因的PCR及双酶切验证 | 第27-28页 |
| ·PCR及双酶切鉴定 | 第28-29页 |
| ·高纯度大提质粒浓度的测定结果 | 第29页 |
| ·BHK细胞转染结果 | 第29-30页 |
| 4 讨论 | 第30-31页 |
| 5 小结 | 第31-32页 |
| 试验二 3A-EGFP、2B-EGFP融合蛋白在BHK细胞中对细胞凋亡的影响以及表达分析 | 第32-38页 |
| 摘要 | 第32-33页 |
| 1 材料 | 第33页 |
| ·菌种和细胞 | 第33页 |
| ·重要试剂 | 第33页 |
| ·实验仪器 | 第33页 |
| 2 方法 | 第33-35页 |
| ·BHK细胞转染过程 | 第33页 |
| ·BHK细胞转染后蛋白样品制备 | 第33页 |
| ·SDS-PAGE和Western blot常用试剂的配置 | 第33-34页 |
| ·SDS-PAG分离胶和浓缩胶的配置 | 第34页 |
| ·融合蛋白 3A-EGFP、2B-EGFP的印记分析 | 第34页 |
| ·2B-p EGFP 、3A-p EGFP诱导BHK细胞凋亡率 | 第34-35页 |
| 3 结果与分析 | 第35-37页 |
| ·细胞克隆的非结构蛋白 3A、2B的表达分析 | 第35页 |
| ·3A-p EGFP、2B- p EGFP和p EGFP-N1 诱导BHK细胞凋亡率 | 第35-37页 |
| 4 讨论 | 第37页 |
| 5 小结 | 第37-38页 |
| 试验三 细胞水平评价抗口蹄疫病毒转基因猪的抗病毒效果 | 第38-52页 |
| 摘要 | 第38-39页 |
| 1 材料和方法 | 第39-45页 |
| ·材料 | 第39页 |
| ·实验材料 | 第39页 |
| ·主要生物试剂 | 第39页 |
| ·主要仪器 | 第39页 |
| ·方法 | 第39-40页 |
| ·采样 | 第39页 |
| ·组织基因组DNA的提取 | 第39-40页 |
| ·目的基因的扩增 | 第40-41页 |
| ·引物的合成 | 第40页 |
| ·PCR的扩增 | 第40页 |
| ·目的基因的回收 | 第40页 |
| ·回收的目的片段与p MD18-T simple载体连接 | 第40-41页 |
| ·转化连接产物 | 第41页 |
| ·转化 | 第41页 |
| ·菌液PCR鉴定重组质粒 | 第41页 |
| ·提取重组质粒 | 第41页 |
| ·标准曲线的建立 | 第41-42页 |
| ·引物设计及合成 | 第41页 |
| ·RNA的提取 | 第41-42页 |
| ·3D基因部分片段的扩增 | 第42页 |
| ·重组质粒制备 | 第42页 |
| ·PCR产物与载体连接、转化 | 第42页 |
| ·质粒的提取和鉴定 | 第42页 |
| ·质粒的定量 | 第42页 |
| ·荧光定量PCR方法的建立 | 第42-43页 |
| ·引物浓度的优化 | 第42页 |
| ·循环条件的优化 | 第42页 |
| ·荧光定量PCR标准曲线的建立 | 第42-43页 |
| ·荧光定量PCR的敏感性检测 | 第43页 |
| ·荧光定量PCR的重复性检测 | 第43页 |
| ·荧光定量PCR的特异性试验 | 第43页 |
| ·临床样品检测 | 第43-45页 |
| ·转基因猪和正常猪成纤维细胞的分离 | 第43页 |
| ·TCID50的测定 | 第43-44页 |
| ·TCID50检测转基因猪成纤维细胞的抗病毒效果 | 第44页 |
| ·攻毒细胞RNA提取及RT-PCR | 第44页 |
| ·RNA纯度的检测 | 第44页 |
| ·RNA反转录 | 第44-45页 |
| ·实时定量 | 第45页 |
| 2 结果与分析 | 第45-50页 |
| ·转基因猪PCR的验证 | 第45-46页 |
| ·转基因基因序列比对 | 第46页 |
| ·病毒RNA的提取和目的基因片段的扩增 | 第46-47页 |
| ·标准模板的鉴定 | 第47页 |
| ·荧光定量PCR方法的建立 | 第47页 |
| ·引物浓度的优化 | 第47页 |
| ·循环条件的优化 | 第47页 |
| ·荧光定量PCR反应条件 | 第47页 |
| ·标准曲线方法的建立和直线回归方程的确立 | 第47-48页 |
| ·敏感性和重复性分析 | 第48-49页 |
| ·荧光定量PCR的特异性试验 | 第49-50页 |
| ·临床样品的检测 | 第50页 |
| 3 讨论 | 第50-51页 |
| 4 小结 | 第51-52页 |
| 全文总结 | 第52-53页 |
| 创新点 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
| 作者简介 | 第60-61页 |
| 附件 | 第61页 |
