| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-14页 |
| 主要符号表 | 第14-15页 |
| 第一部分 文献综述 | 第15-24页 |
| ·酸性蛋白酶的作用机理 | 第15页 |
| ·酸性蛋白酶的酶学特性 | 第15页 |
| ·国内外酸性蛋白酶的研究概况 | 第15-16页 |
| ·酸性蛋白酶的应用 | 第16页 |
| ·在酿酒工业中的应用 | 第16页 |
| ·在饲料工业中的应用 | 第16页 |
| ·在皮革工业中的应用 | 第16页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第16-19页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的优点 | 第17页 |
| ·表达菌株 | 第17-18页 |
| ·表达载体 | 第18页 |
| ·外源基因的整合方式 | 第18页 |
| ·转化方法 | 第18-19页 |
| ·选择性标记 | 第19页 |
| ·提高外源蛋白在毕赤酵母中表达量的策略 | 第19-23页 |
| ·优化目的基因序列 | 第19页 |
| ·选择高表达的启动子 | 第19-20页 |
| ·选择合适的信号肽 | 第20页 |
| ·筛选高拷贝菌株 | 第20-21页 |
| ·优化发酵工艺 | 第21-23页 |
| ·本文的研究目的与意义 | 第23-24页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第24-43页 |
| ·材料 | 第24-30页 |
| ·菌株 | 第24页 |
| ·质粒 | 第24-25页 |
| ·培养基 | 第25页 |
| ·药品试剂 | 第25-26页 |
| ·仪器与设备 | 第26页 |
| ·实验主要溶液的配制方法 | 第26-28页 |
| ·引物 | 第28-30页 |
| ·实验方法 | 第30-43页 |
| ·PCR扩增PepA基因 | 第30-31页 |
| ·纯化PCR产物 | 第31-32页 |
| ·Muts处理PCR产物 | 第32页 |
| ·Native-PAGE电泳 | 第32-33页 |
| ·T4 DNA聚合酶处理纯化后的目的片段 | 第33页 |
| ·SDS碱裂解法提取质粒DNA | 第33页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备及其转化方法 | 第33-34页 |
| ·表达载体的构建 | 第34页 |
| ·毕赤酵母感受态的制备及其转化方法 | 第34-35页 |
| ·外源基因在毕赤酵母中的摇瓶诱导表达 | 第35页 |
| ·蛋白质的纯化 | 第35页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白 | 第35-36页 |
| ·Bradford法测定蛋白浓度 | 第36-37页 |
| ·酸性蛋白酶酶活的测定方法 | 第37-39页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第39-41页 |
| ·外源基因在毕赤酵母中的发酵罐诱导表达 | 第41-42页 |
| ·酸性蛋白酶酶学性质的测定 | 第42-43页 |
| 第三部分 结果与分析 | 第43-64页 |
| ·宇佐美曲霉PepA基因密码子的合成 | 第43-44页 |
| ·pHBM905A-pepA表达载体的构建 | 第44-45页 |
| ·pHBM905A-pepA毕赤酵母的转化及其转化子的鉴定 | 第45-46页 |
| ·宇佐美曲霉PepA在毕赤酵母中的表达 | 第46-47页 |
| ·pHBM905BDM-pepA毕赤酵母表达载体的构建和表达 | 第47页 |
| ·pHBM905BDM-pepA多拷贝毕赤酵母表达载体的构建 | 第47-50页 |
| ·1-4拷贝pHBM905BDM-pepA在毕赤酵母中的表达 | 第50页 |
| ·比较不同菌株表达宇佐美曲霉PepA的蛋白浓度及酶活 | 第50-52页 |
| ·pepA在不同菌株差异表达的分析 | 第52-56页 |
| ·不同菌株RNA的抽提和质量检测 | 第52-53页 |
| ·定量PCR产物的特异性 | 第53-54页 |
| ·荧光实时定量样品扩增曲线图 | 第54-55页 |
| ·不同菌株PepA基因差异表达的相对定量分析 | 第55-56页 |
| ·宇佐美曲霉PepA的糖基化分析 | 第56-58页 |
| ·PepA酶学性质分析 | 第58-62页 |
| ·PepA的分离纯化 | 第58-59页 |
| ·温度对PepA活性的影响 | 第59-61页 |
| ·pH对PepA活性的影响 | 第61页 |
| ·不同添加剂对PepA活性的影响 | 第61-62页 |
| ·PepA高密度发酵 | 第62-64页 |
| 第四部分 讨论与展望 | 第64-67页 |
| ·讨论 | 第64-66页 |
| ·展望 | 第66-67页 |
| 第五部分 结论 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
