| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-14页 |
| 主要符号表 | 第14-16页 |
| 第一部分 文献综述 | 第16-36页 |
| 1 假单胞菌简介 | 第16-18页 |
| ·几种常见的假单胞杆菌 | 第16-18页 |
| ·铜绿假单胞杆菌 | 第16-17页 |
| ·荧光假单胞杆菌 | 第17页 |
| ·丁香假单胞杆菌 | 第17-18页 |
| 2 Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS) | 第18-28页 |
| ·Ⅲ型分泌系统简介 | 第18页 |
| ·Ⅲ型分泌系统的核心结构-针状复合体(Needle Complex,NC) | 第18-21页 |
| ·针状复合体的组装 | 第21-22页 |
| ·底物的转运 | 第22-24页 |
| ·植物病原菌中的T3SS | 第24-26页 |
| ·T3SS在植物病原菌侵染宿主中的作用 | 第26-28页 |
| 3 基因克隆的常用方法简介 | 第28-32页 |
| ·根据已知序列克隆基因 | 第28-29页 |
| ·根据已知探针克隆基因 | 第29页 |
| ·未知基因的打靶 | 第29-32页 |
| ·随机引物法克隆目的基因 | 第29-30页 |
| ·Differential display PCR(DD-PCR) | 第30页 |
| ·Representative difference analysis PCR(RDA-PCR) | 第30-31页 |
| ·用特异抗体克隆基因 | 第31页 |
| ·特异基因的功能克隆 | 第31-32页 |
| 4 常用蛋白质分离纯化方法简介 | 第32-34页 |
| ·根据蛋白质溶解度不同的分离方法 | 第32-33页 |
| ·蛋白质的盐析 | 第32页 |
| ·等电点沉淀法 | 第32页 |
| ·低温有机溶剂沉淀法 | 第32-33页 |
| ·根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 | 第33页 |
| ·透析与超滤 | 第33页 |
| ·凝胶过滤法 | 第33页 |
| ·根据蛋白质带电性质进行分离 | 第33-34页 |
| ·电泳法 | 第33页 |
| ·离子交换层析法 | 第33-34页 |
| ·根据配体特异性的分离方法一亲和色谱法 | 第34页 |
| 5 本研究的目的及意义 | 第34-36页 |
| 第二部分 实验部分 | 第36-137页 |
| 1 实验材料,仪器与试剂 | 第36-42页 |
| ·实验菌株,载体和引物 | 第36-38页 |
| ·主要仪器与设备 | 第38-39页 |
| ·主要试剂 | 第39页 |
| ·所用培养基及配制 | 第39-40页 |
| ·主要溶液及其配制 | 第40-42页 |
| ·细菌总DNA抽提相关试剂 | 第40页 |
| ·质粒DNA抽提相关试剂 | 第40页 |
| ·DNA电泳相关试剂 | 第40-41页 |
| ·诱导表达试剂 | 第41页 |
| ·SDS-PAGE所用溶液及胶的配制 | 第41-42页 |
| ·考马斯亮蓝法测蛋白质浓度所需试剂 | 第42页 |
| 2 实验方法 | 第42-57页 |
| ·T3SS中hrp/hrc基因簇的克隆 | 第42-46页 |
| ·P.syringae pv.syringae van Hall 1336基因组DNA的制备 | 第42-43页 |
| ·hrp/hrc基因克隆 | 第43-46页 |
| ·PCR产物分别连T载,转化,阳性克隆子的筛选 | 第46-48页 |
| ·PCR产物的回收纯化 | 第46-47页 |
| ·PCR产物与T载连接、转化大肠杆菌 | 第47页 |
| ·DH5 α感受态细胞的制备 | 第47-48页 |
| ·阳性克隆子的筛选 | 第48页 |
| ·hrp/hrc基因的表达载体的构建以及表达 | 第48-51页 |
| ·表达载体的构建 | 第48-50页 |
| ·hrp/hrc基因的诱导表达 | 第50页 |
| ·Tris-甘氨酸SDS-PAGE电泳 | 第50-51页 |
| ·Hrp/Hrc蛋白的纯化 | 第51-56页 |
| ·Hrp/Hrc-6his蛋白的纯化 | 第51-54页 |
| ·GST融合蛋白的纯化 | 第54-56页 |
| ·Hrp/Hrc蛋白的多抗制备 | 第56页 |
| ·阴性对照设置 | 第56页 |
| ·基础免疫 | 第56页 |
| ·加强免疫 | 第56页 |
| ·抗血清的获得 | 第56页 |
| ·ELISA检测抗体效价 | 第56-57页 |
| 3 实验结果 | 第57-137页 |
| ·hrp/hrc基因的克隆 | 第57-116页 |
| ·hrcJ基因的克隆及其生物信息学分析 | 第57-60页 |
| ·hrcR基因的克隆及其生物信息学分析 | 第60-62页 |
| ·hrcS基因的克隆及其生物信息学分析 | 第62-65页 |
| ·hrcU基因的克隆及其生物信息学分析 | 第65-68页 |
| ·hrcT基因的克隆及其生物信息学分析 | 第68-71页 |
| ·hrcV基因的克隆及其生物信息学分析 | 第71-74页 |
| ·hrcQa基因的克隆及其生物信息学分析 | 第74-77页 |
| ·hrcQb基因的克隆及其生物信息学分析 | 第77-80页 |
| ·hrpA2基因的克隆及其生物信息学分析 | 第80-82页 |
| ·hrpB基因的克隆及其生物信息学分析 | 第82-84页 |
| ·hrpD基因的克隆及其生物信息学分析 | 第84-87页 |
| ·hrpE基因的克隆及其生物信息学分析 | 第87-89页 |
| ·hrpF基因的克隆及其生物信息学分析 | 第89-92页 |
| ·hrpG基因的克隆及其生物信息学分析 | 第92-94页 |
| ·hrpK1基因的克隆及其生物信息学分析 | 第94-99页 |
| ·hrpO基因的克隆及其生物信息学分析 | 第99-101页 |
| ·hrpQ基因的克隆及其生物信息学分析 | 第101-105页 |
| ·hrpR基因的克隆及其生物信息学分析 | 第105-108页 |
| ·hrpS基因的克隆及其生物信息学分析 | 第108-111页 |
| ·hrpT基因的克隆及其生物信息学分析 | 第111-113页 |
| ·hrpV基因的克隆及其生物信息学分析 | 第113-116页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第116-117页 |
| ·pET23a重组质粒的构建 | 第116-117页 |
| ·pGEX-6p-1重组质粒的构建 | 第117页 |
| ·蛋白的表达 | 第117-126页 |
| ·HrcJ蛋白的表达 | 第117-118页 |
| ·HrpU蛋白的表达 | 第118页 |
| ·HrcQa蛋白的表达 | 第118-119页 |
| ·HrpA2蛋白的表达 | 第119-120页 |
| ·HrpE和HrpS蛋白的表达 | 第120页 |
| ·HrpG蛋白的表达 | 第120-121页 |
| ·HrpO蛋白的表达 | 第121页 |
| ·HrpR蛋白的表达 | 第121-122页 |
| ·HrpV蛋白的表达 | 第122页 |
| ·GST-HrcQb蛋白的表达 | 第122-123页 |
| ·GST-HrpQ蛋白的表达 | 第123页 |
| ·GST-HrpD蛋白的表达 | 第123-124页 |
| ·GST-HrpB蛋白的表达 | 第124页 |
| ·GST-HrpF蛋白的表达 | 第124-125页 |
| ·HrpT蛋白的表达 | 第125-126页 |
| ·蛋白的纯化 | 第126-133页 |
| ·HrpG蛋白的纯化 | 第126页 |
| ·HrpO蛋白的纯化 | 第126-127页 |
| ·HrpV蛋白的纯化 | 第127-128页 |
| ·HrpS蛋白的纯化 | 第128-129页 |
| ·HrpR蛋白的纯化 | 第129页 |
| ·HrpA2蛋白的纯化 | 第129-130页 |
| ·HrpE蛋白的纯化 | 第130-131页 |
| ·HrcJ蛋白的纯化 | 第131页 |
| ·GST-HrcQb蛋白的纯化 | 第131-132页 |
| ·GST-HrpD蛋白的纯化 | 第132-133页 |
| ·Hrp/Hrc蛋白多克隆抗体的制备与效价鉴定 | 第133-137页 |
| ·GST-HrcQb和HrpR蛋白多抗ELISA法效价测定 | 第133-134页 |
| ·HrpO蛋白多抗ELISA法效价测定 | 第134-135页 |
| ·HrpG蛋白多抗ELISA法效价测定 | 第135页 |
| ·HrpS和HrpV蛋白多抗ELISA法效价测定 | 第135-137页 |
| 第三部分 总结与展望 | 第137-141页 |
| 参考文献 | 第141-147页 |
| 致谢 | 第147页 |
