| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-13页 |
| 缩略词表 | 第13-14页 |
| 第一章 前言 | 第14-28页 |
| 1 典型环境内分泌干扰物:己烯雌酚的概况 | 第15-20页 |
| ·己烯雌酚的物理性质 | 第15-16页 |
| ·己烯雌酚的应用 | 第16页 |
| ·己烯雌酚的毒副作用 | 第16-17页 |
| ·己烯雌酚残留检测 | 第17-20页 |
| ·气相色谱法 | 第18页 |
| ·高效液相色谱法 | 第18-19页 |
| ·薄层色谱法 | 第19页 |
| ·化学发光法 | 第19页 |
| ·放射免疫分析 | 第19-20页 |
| ·荧光免疫分析 | 第20页 |
| ·酶免疫分析技术 | 第20页 |
| 2 核糖体展示技术的研究进展 | 第20-26页 |
| ·核糖体展示技术的原理 | 第22-23页 |
| ·核糖体展示技术的优点 | 第23-24页 |
| ·核糖体展示技术已经用于多种大分子的抗体筛选 | 第24页 |
| ·体外分子进化 | 第24-25页 |
| ·利用展示技术从非天然抗体库中筛选小分子污染物的抗体 | 第25-26页 |
| ·利用展示技术从天然抗体库中筛选小分子污染物的抗体 | 第26页 |
| 3 研究目的及意义 | 第26-28页 |
| 第二章 单链抗体文库的构建 | 第28-51页 |
| 1 材料与方法 | 第28-38页 |
| ·材料 | 第28-29页 |
| ·实验动物 | 第28页 |
| ·主要试剂 | 第28-29页 |
| ·主要仪器 | 第29页 |
| ·方法 | 第29-38页 |
| ·Trizol法提取鼠脾总RNA | 第29-30页 |
| ·cDNA的合成 | 第30-31页 |
| ·鼠源天然单链抗体文库的构建 | 第31-36页 |
| ·VH基因片段的扩增 | 第31-32页 |
| ·VL基因片段的扩增 | 第32页 |
| ·linker连接片段的扩增 | 第32-33页 |
| ·linker连接片段的序列正确性鉴定 | 第33-35页 |
| ·scFv文库的构建 | 第35-36页 |
| ·单链抗体文库的多样性鉴定 | 第36页 |
| ·核糖体展示元件的扩增 | 第36-37页 |
| ·T片段的扩增及序列鉴定 | 第36页 |
| ·P片段的扩增及序列鉴定 | 第36-37页 |
| ·单链抗体核糖体展示文库构建 | 第37-38页 |
| ·T片段与单链抗体文库的连接 | 第37页 |
| ·P片段与T+S的连接 | 第37-38页 |
| 2 结果与分析 | 第38-48页 |
| ·小鼠脾脏总RNA的提取 | 第38-39页 |
| ·VH,VL以及linker的扩增 | 第39-40页 |
| ·Linker序列的鉴定 | 第40-41页 |
| ·scFv文库的合成 | 第41-42页 |
| ·scFv文库的序列鉴定 | 第42-45页 |
| ·T片段和P片段的扩增及序列鉴定 | 第45-47页 |
| ·核糖体展示文库的合成 | 第47-48页 |
| 3 讨论 | 第48-51页 |
| ·小鼠脾脏总RNA的提取 | 第48-49页 |
| ·单链抗体文库的构建 | 第49-50页 |
| ·核糖体展示元件的扩增及文库的连接 | 第50-51页 |
| 第三章 单链抗体核糖体展示文库的质量鉴定 | 第51-60页 |
| 1 材料与方法 | 第51-55页 |
| ·材料 | 第51-52页 |
| ·主要试剂 | 第51页 |
| ·主要仪器 | 第51-52页 |
| ·方法 | 第52-55页 |
| ·核糖体展示文库的可扩增性鉴定 | 第52页 |
| ·核糖体展示文库的完整性与多样性鉴定 | 第52-53页 |
| ·制备E.coli DH5α感受态细胞 | 第52-53页 |
| ·核糖体展示文库的序列测定 | 第53页 |
| ·核糖体展示文库的转录活性与反转录活性鉴定 | 第53-55页 |
| ·核糖体展示文库的转录活性鉴定 | 第53-54页 |
| ·核糖体展示文库的反转录活性鉴定 | 第54-55页 |
| 2 结果与分析 | 第55-59页 |
| ·核糖体展示文库的可扩增性鉴定 | 第55-56页 |
| ·核糖体展示文库的序列完整性及多样性鉴定 | 第56-57页 |
| ·核糖体展示文库转录活性鉴定 | 第57-58页 |
| ·核糖体展示文库反转录活性鉴定 | 第58-59页 |
| 3 讨论 | 第59-60页 |
| 第四章 利用核糖体展示技术筛选anti-DES单链抗体 | 第60-70页 |
| 1 材料与方法 | 第60-64页 |
| ·材料 | 第60-61页 |
| ·主要试剂 | 第60页 |
| ·主要仪器 | 第60-61页 |
| ·方法 | 第61-64页 |
| ·羧基化的DES与氨基化磁珠的偶联及鉴定 | 第61-62页 |
| ·羧基化的DES与氨基化磁珠的偶联 | 第61页 |
| ·偶联后磁珠的鉴定 | 第61-62页 |
| ·核糖体展示单链抗体文库体外转录与翻译 | 第62页 |
| ·固相亲和筛选 | 第62-63页 |
| ·液相亲和筛选 | 第63页 |
| ·分离纯化mRNA | 第63页 |
| ·纯化后mRNA的RT-PCR | 第63页 |
| ·重新构建下一轮的RD模板 | 第63页 |
| ·筛选后单链抗体文库的鉴定 | 第63-64页 |
| 2 结果与分析 | 第64-67页 |
| ·体外筛选 | 第64-66页 |
| ·第四轮,第五轮和第七轮筛选后的RT-PCR产物的序列测定 | 第66-67页 |
| 3 讨论 | 第67-70页 |
| ·体外表达 | 第67-68页 |
| ·亲和筛选及筛选效率的评价 | 第68-69页 |
| ·RT-PCR扩增 | 第69页 |
| ·筛选后序列分析 | 第69-70页 |
| 第五章 筛选后单链抗体基因的表达质粒的构建、蛋白表达 | 第70-80页 |
| 1 材料与方法 | 第70-75页 |
| ·材料 | 第70-71页 |
| ·质粒与菌株 | 第70页 |
| ·主要试剂 | 第70-71页 |
| ·主要仪器 | 第71页 |
| ·方法 | 第71-75页 |
| ·筛选后单链抗体基因的扩增 | 第71-72页 |
| ·重组scFv原核表达质粒构建 | 第72页 |
| ·制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞 | 第72-73页 |
| ·表达质粒pTIG-TRX-scFv的构建和鉴定 | 第73-74页 |
| ·筛选后单链抗体蛋白的表达 | 第74页 |
| ·scFv表达蛋白Western Blot的检测 | 第74-75页 |
| 2 结果与分析 | 第75-78页 |
| ·pTIG-TRX-scFv阳性克隆子验证 | 第75-76页 |
| ·pTIG-TRX-scFv的诱导表达 | 第76-77页 |
| ·Western Blot鉴定表达的单链抗体 | 第77-78页 |
| 3 讨论 | 第78-80页 |
| 第六章 单链抗体的性质鉴定 | 第80-91页 |
| 1 材料与方法 | 第80-84页 |
| ·材料 | 第80-82页 |
| ·主要试剂 | 第80页 |
| ·主要仪器 | 第80-81页 |
| ·主要试剂的配制 | 第81-82页 |
| ·方法 | 第82-84页 |
| ·ELISA法测定单链抗体与抗原结合活性 | 第82页 |
| ·间接竞争ELISA鉴定单链抗体与半抗原DES的特异结合活性 | 第82页 |
| ·筛选有竞争活性的单链抗体序列比对 | 第82-83页 |
| ·用SPR测定筛选后单链抗体的亲和力 | 第83页 |
| ·抗原的固定 | 第83页 |
| ·动力学常数的测定 | 第83页 |
| ·可溶性scFv的纯化 | 第83-84页 |
| ·Ni柱再生 | 第83-84页 |
| ·Ni柱纯化 | 第84页 |
| 2 结果与分析 | 第84-89页 |
| ·单链抗体结合活性的检测 | 第84-85页 |
| ·筛选后单链抗体的竞争活性的检测 | 第85-86页 |
| ·有竞争活性的单链抗体序列比对 | 第86-87页 |
| ·SPR分析单链抗体的亲和力 | 第87-88页 |
| ·单链抗体的纯化 | 第88-89页 |
| 3 讨论 | 第89-91页 |
| 结论 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-100页 |
| 附录 | 第100-102页 |
| 致谢 | 第102页 |
