| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略词表 | 第10-12页 |
| 前言 | 第12-13页 |
| 第一部分 miR99a 在临床样本和肝癌细胞系中的检测 | 第13-22页 |
| (一)实验材料 | 第13-15页 |
| 1、临床组织和资料搜集 | 第13页 |
| 2、实验细胞株 | 第13页 |
| 3、实验试剂 | 第13-14页 |
| 4、实验仪器设备 | 第14页 |
| 5、实验溶液的配制 | 第14-15页 |
| 6、实验所需引物 | 第15页 |
| (二)实验方法及步骤 | 第15-18页 |
| 1、细胞培养 | 第15-16页 |
| 2、样品的制备 | 第16页 |
| 3、 Realtime qRTPCR 检测 MiR99a 在肝癌细胞系的表达 | 第16-17页 |
| 4、数据分析 | 第17-18页 |
| (三)实验结果. | 第18-21页 |
| 1、 miR99a 在肝癌组织之中低表达并且与肝癌预后相关 | 第18-21页 |
| 2、miR99a 在肝癌细胞株中低表达 | 第21页 |
| (四)讨论 | 第21-22页 |
| 第二部分 质粒的构建和腺病毒的包装 | 第22-37页 |
| (一)实验材料. | 第22-25页 |
| 1、实验载体和试剂 | 第22-23页 |
| 2、实验仪器设备 | 第23页 |
| 3、实验溶液的配制 | 第23-24页 |
| 4、引物 | 第24-25页 |
| (二)实验方法及步骤. | 第25-34页 |
| 1、质粒的构建步骤 | 第25-34页 |
| (三)实验结果 | 第34-35页 |
| 1、质粒 pDC329miR99a 、DuallucEIF2C23'UTR 和 DuallucEIF2C23'UTRD 的 PCR鉴定 | 第34页 |
| 2、重组腺病毒 Ad5miR99a 的鉴定 | 第34-35页 |
| 3、大量扩增后测定病毒滴度 | 第35页 |
| (四)讨论 | 第35-37页 |
| 第三部分 miR99a 抑制肝癌细胞生长的体外和体内实验 | 第37-46页 |
| (一)实验材料 | 第37-38页 |
| 1、实验试剂及腺病毒 | 第37页 |
| 2、仪器设备 | 第37-38页 |
| 3、实验溶液的配制 | 第38页 |
| 4、实验动物 | 第38页 |
| (二)实验方法和步骤 | 第38-40页 |
| 1、细胞培养 | 第38页 |
| 2、 MTT | 第38-39页 |
| 3、肿瘤细胞集落形成实验 | 第39页 |
| 4、 BALB/c 裸鼠肝癌移植瘤模型的建立 | 第39-40页 |
| 5、统计学处理 | 第40页 |
| (三)实验结果 | 第40-44页 |
| 1、检测细胞活力（MTT 法） | 第40-41页 |
| 2、集落形成实验检测细胞增殖能力 | 第41-42页 |
| 3、 miR99a 抑制 HCC 生长的体内实验 | 第42-44页 |
| (四)讨论 | 第44-46页 |
| 第四部分 miR99a 靶向调控 EIF2C2/PTEN | 第46-62页 |
| (一)实验材料 | 第46-49页 |
| 1、主要试剂和载体 | 第46-47页 |
| 2、主要仪器 | 第47页 |
| 3、主要溶液 | 第47-49页 |
| (二)实验方法及步骤 | 第49-54页 |
| 1、双荧光素酶报告系统检测 miR99a 抑制 EIF2C23UTR 靶序列的情况 | 第49-50页 |
| 2、 Western blot | 第50-52页 |
| 3、免疫荧光实验步骤 | 第52-53页 |
| 4、 qRTPCR 在肝癌组织中检测 EIF2C2 的表达 | 第53页 |
| 5、免疫组化 | 第53-54页 |
| (三)实验结果 | 第54-60页 |
| 1、预测 miR99a 的靶基因 | 第54页 |
| 2、双荧光素酶报告基因系统 | 第54-55页 |
| 3、 Westen blot 检测 miR99a 对 EIF2C2 蛋白的抑制作用 | 第55-56页 |
| 4、免疫荧光检测 miR99a 对 EIF2C2 蛋白的抑制作用 | 第56页 |
| 5、 qRTPCR 在肝癌组织中验证 miR99a 与 EIF2C2 的表达负相关 | 第56-57页 |
| 6、免疫组化验证肝癌组织中 miR99a 与 EIF2C2 蛋白的表达负相关 | 第57-58页 |
| 7、 Westen blot 验证肝癌组织中 miR99a 与 EIF2C2 蛋白的表达负相关 | 第58-59页 |
| 8、 Westen blot 检测 miR99a 靶向调控 EIF2C2/PTEN信号通路 | 第59页 |
| 9、 Westen blot 检测 EIF2C2 干扰后 EIF2C2 和 PTEN的表达 | 第59-60页 |
| (四)讨论 | 第60-62页 |
| 全文小结 | 第62-64页 |
| 文献综述 | 第64-71页 |
| 参考文献 | 第71-77页 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
