| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-24页 |
| ·链霉菌与美达霉素 | 第11-15页 |
| ·链霉菌概述 | 第11-13页 |
| ·美达霉素 | 第13-15页 |
| ·糖基化和糖基转移酶 | 第15-19页 |
| ·糖基化 | 第15-16页 |
| ·糖基转移酶 | 第16-19页 |
| ·定点突变技术 | 第19-23页 |
| ·不依赖于PCR的定点诱变技术 | 第19-21页 |
| ·PCR介导的定点突变方法 | 第21-23页 |
| ·本研究目的和意义 | 第23-24页 |
| 第二章 材料与方法 | 第24-33页 |
| ·菌株 | 第24-25页 |
| ·质粒 | 第25-26页 |
| ·培养基 | 第26-28页 |
| ·大肠杆菌培养基 | 第26页 |
| ·链霉菌培养基 | 第26-28页 |
| ·试剂 | 第28-30页 |
| ·大肠杆菌质粒提取试剂 | 第28页 |
| ·链霉菌DNA的提取 | 第28页 |
| ·SDS-PAGE和Western Blotting试剂 | 第28-29页 |
| ·蛋白纯化试剂 | 第29页 |
| ·链霉菌原生质体制备和转化试剂 | 第29页 |
| ·生化试剂和酶 | 第29页 |
| ·抗生素 | 第29-30页 |
| ·实验方法 | 第30-33页 |
| ·碱裂解法提取大肠杆菌质粒 | 第30页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞中制备和转化 | 第30页 |
| ·链霉菌的培养 | 第30-31页 |
| ·DNA体外操作 | 第31页 |
| ·Western Blotting | 第31页 |
| ·蛋白纯化 | 第31页 |
| ·链霉菌原生质体制备及转化 | 第31页 |
| ·链霉菌DNA的制备 | 第31-33页 |
| 第三章 Med-ORF8生物信息学分析 | 第33-41页 |
| ·Med-ORF8点突变位点的初步确定 | 第33-34页 |
| ·Med-ORF8结构分析和计算机模拟 | 第34-39页 |
| ·Med-ORF8一级结构分析 | 第34-36页 |
| ·Med-ORF8二级结构分析 | 第36-37页 |
| ·Med-ORF8结构域的预测以及特定Motif分析 | 第37-38页 |
| ·Med-ORF8三维结构预测 | 第38-39页 |
| ·讨论 | 第39-41页 |
| 第四章 利用改进的大引物PCR点突变方法对med-ORF8基因进行点突变 | 第41-48页 |
| ·方案设计 | 第41-43页 |
| ·效果验证 | 第43-47页 |
| ·med-ORF8定点突变扩增 | 第43-44页 |
| ·PCR产物序列验证 | 第44-47页 |
| ·讨论 | 第47-48页 |
| 第五章 点突变基因(med-ORF8~*)原核表达系统的建立和蛋白表达的系统优化 | 第48-63页 |
| ·点突变基因(med-ORF8~*)原核表达系统的建立 | 第48-53页 |
| ·表达质粒pHSL71-8的构建 | 第50页 |
| ·构建表达质粒pHSL74-6 | 第50-51页 |
| ·表达质粒pHSL75-1的构建 | 第51-53页 |
| ·Med-ORF8~*的原核表达工程菌的构建 | 第53页 |
| ·突变med-ORF8~*的初步诱导表达 | 第53-57页 |
| ·pET-23a-BL21(DE3)系统(即BL21(DE3)/pHSL71-8) | 第53-55页 |
| ·pET-28a-BL21(DE3)系统 | 第55-57页 |
| ·Med-ORF8~*可溶性表达条件的优化 | 第57-60页 |
| ·不同诱导因子及其不同浓度对可溶性蛋白含量的影响 | 第58-59页 |
| ·不同温度对目的蛋白可溶性含量的影响 | 第59-60页 |
| ·BL21(DE3)/plyS-pET系统 | 第60页 |
| ·蛋白纯化 | 第60-61页 |
| ·讨论 | 第61-63页 |
| ·几种不同表达系统的比较 | 第61页 |
| ·包涵体的形成原因以及减少包涵体的策略 | 第61-62页 |
| ·融合蛋白纯化存在问题 | 第62-63页 |
| 第六章 Med-ORF8~*在链霉菌中初步功能验证 | 第63-69页 |
| ·链霉菌表达质粒的构建 | 第63-65页 |
| ·点突变基因med-ORF8~*功能初步验证 | 第65-67页 |
| ·链霉菌互补表达系统的建立 | 第65-67页 |
| ·讨论 | 第67-69页 |
| 第七章 链霉菌AM-7161中与美达霉素合成相关次生代谢产物的研究 | 第69-76页 |
| ·美达霉素产生菌中有化合物X积累 | 第69-70页 |
| ·化合物X的合成与美达霉素基因簇有关 | 第70-72页 |
| ·化合物X的分离纯化 | 第72-73页 |
| ·链霉菌发酵产物的粗提 | 第72页 |
| ·硅胶柱层析纯化X | 第72-73页 |
| ·讨论 | 第73-76页 |
| 总结与展望 | 第76-78页 |
| 附录 | 第78-80页 |
| 参考文献 | 第80-88页 |
| 硕士期间发表的论文 | 第88-89页 |
| 致谢 | 第89-90页 |
