| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-8页 |
| 第一章 绪论 | 第8-16页 |
| ·概述 | 第8页 |
| ·利钠肽家族介绍 | 第8-10页 |
| ·ANP (A-型利钠肽) | 第8页 |
| ·BNP (B-型利钠肽) | 第8-9页 |
| ·CNP (C-型利钠肽) | 第9页 |
| ·DNP (D-型利钠肽) | 第9页 |
| ·VNP (血管钠肽) | 第9-10页 |
| ·利钠肽的生理效应 | 第10-12页 |
| ·NPR 受体的结构及其功能 | 第10-11页 |
| ·激素效应 | 第11页 |
| ·血液动力学效应 | 第11页 |
| ·肾动力学效应 | 第11-12页 |
| ·抗心肌肥大及心肌纤维化 | 第12页 |
| ·利钠肽的代谢途径 | 第12页 |
| ·多肽生产方法 | 第12-13页 |
| ·大肠杆菌表达多肽策略 | 第13-14页 |
| ·载体与宿主的选择 | 第13页 |
| ·培养方法及诱导条件的选择 | 第13-14页 |
| ·改变蛋白质结构增加可溶性 | 第14页 |
| ·立题背景及研究内容 | 第14-16页 |
| ·立题背景及目的 | 第14-15页 |
| ·研究内容 | 第15-16页 |
| 第二章 VNP 基因的克隆及表达载体pGEX-4T-1-VNP 的构建 | 第16-25页 |
| ·材料 | 第16-18页 |
| ·质粒和菌种 | 第16-17页 |
| ·培养基 | 第17页 |
| ·工具酶 | 第17页 |
| ·主要试剂 | 第17页 |
| ·仪器与设备 | 第17-18页 |
| ·方法 | 第18-21页 |
| ·质粒pGEX-4T-1 的提取 | 第18页 |
| ·VNP 基因序列优化 | 第18-19页 |
| ·引物设计与合成 | 第19页 |
| ·VNP 基因的PCR 扩增 | 第19页 |
| ·PCR 扩增的VNP 基因片段的纯化 | 第19-20页 |
| ·VNP 基因片段和质粒pGEX-4T-1 的EcoR I 和Not I 消化 | 第20页 |
| ·VNP 基因片段与pGEX-4T-1 载体连接 | 第20页 |
| ·感受态细胞的制备及重组质粒的转化 | 第20页 |
| ·质粒pGEX-4T-1-VNP 的菌落PCR 鉴定 | 第20-21页 |
| ·基因工程菌BL21(DE3)/pGEX-4T-1-VNP 构建 | 第21页 |
| ·结果 | 第21-24页 |
| ·VNP 基因的PCR 扩增 | 第21页 |
| ·重组质粒pGEX-4T-1-VNP 的构建及鉴定 | 第21-23页 |
| ·重组质粒pGEX-4T-1-VNP 的序列测定 | 第23页 |
| ·基因工程菌BL21(DE3)/pGEX-4T-1-VNP 构建 | 第23-24页 |
| ·讨论 | 第24页 |
| ·小结 | 第24-25页 |
| 第三章 重组VNP 蛋白的制备与分离纯化 | 第25-40页 |
| ·材料 | 第25-27页 |
| ·菌株及质粒 | 第25页 |
| ·培养基 | 第25页 |
| ·蛋白酶，抗体与试剂 | 第25-26页 |
| ·仪器与设备 | 第26-27页 |
| ·方法 | 第27-30页 |
| ·融合蛋白GST-VNP 的诱导表达 | 第27页 |
| ·融合蛋白GST-VNP 的诱导表达条件优化 | 第27页 |
| ·融合蛋白GST-VNP 的制备 | 第27-28页 |
| ·菌体的超声波破碎 | 第28页 |
| ·GST 琼脂糖凝胶亲和层析 | 第28页 |
| ·HPLC 检测蛋白质样品纯度 | 第28页 |
| ·Sephadex G25 凝胶过滤 | 第28-29页 |
| ·重组VNP 蛋白的制备 | 第29页 |
| ·重组VNP 蛋白的纯化 | 第29页 |
| ·重组VNP 蛋白的western blot 鉴定 | 第29-30页 |
| ·Tricine-SDS-PAGE 电泳检测小分子量蛋白质 | 第30页 |
| ·Bradford 法测定总蛋白量 | 第30页 |
| ·结果 | 第30-39页 |
| ·pGEX-4T-1-VNP 在E. coli BL21(DE3)中表达和条件优化 | 第30-32页 |
| ·融合蛋白GST-VNP 的可溶性表达分析 | 第32页 |
| ·GST 琼脂糖凝胶亲和层析结果 | 第32-34页 |
| ·Sephadex G25 凝胶过滤AKTA basic 分析结果 | 第34页 |
| ·肠激酶酶切Tricine-SDS-PAGE 分析 | 第34-35页 |
| ·VNP 纯化后Tricine-SDS-PAGE 分析 | 第35-36页 |
| ·VNP 的western blot 鉴定及质谱分析 | 第36-37页 |
| ·VNP 蛋白N 端测序 | 第37-39页 |
| ·讨论 | 第39页 |
| ·小结 | 第39-40页 |
| 第四章 重组VNP 蛋白的活性研究 | 第40-49页 |
| ·材料 | 第40-41页 |
| ·动物材料 | 第40页 |
| ·实验细胞株材料 | 第40页 |
| ·主要试剂 | 第40-41页 |
| ·仪器与设备 | 第41页 |
| ·方法 | 第41-43页 |
| ·细胞株Raw264.7 细胞的培养条件 | 第41页 |
| ·VNP 对Raw264.7 中的iNOS、TNFαm RNA 水平的抑制作用 | 第41页 |
| ·总RNA 的提取 | 第41-42页 |
| ·总RNA 的浓度及质量鉴定 | 第42页 |
| ·总RNA 的反转录反应 | 第42页 |
| ·荧光定量PCR | 第42-43页 |
| ·VNP 血管舒张活性测定 | 第43页 |
| ·VNP 利尿作用测定 | 第43页 |
| ·结果 | 第43-47页 |
| ·重组VNP 在舒张血管方面比较 | 第43-44页 |
| ·重组VNP 在利尿方面比较 | 第44-45页 |
| ·总RNA 提取 | 第45页 |
| ·细胞水平活性测定结果 | 第45-47页 |
| ·讨论 | 第47-48页 |
| ·小结 | 第48-49页 |
| 第五章 结论与展望 | 第49-50页 |
| ·结论 | 第49页 |
| ·展望 | 第49-50页 |
| 致谢 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-55页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第55页 |
