| 中文摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-14页 |
| 缩略语 | 第14-16页 |
| 1 前言 | 第16-60页 |
| ·古菌概述 | 第16-24页 |
| ·古菌的多样性及分类 | 第17-18页 |
| ·古菌的细胞结构、遗传特性及基因组特征 | 第18-21页 |
| ·古菌的应用价值 | 第21页 |
| ·极端嗜热古菌和硫化叶菌概述 | 第21-24页 |
| ·极端嗜热古菌 | 第21-22页 |
| ·硫化叶菌 | 第22-24页 |
| ·DNA复制起始 | 第24-49页 |
| ·DNA复制原点 | 第25-29页 |
| ·原核DNA复制原点 | 第26页 |
| ·真核DNA复制原点 | 第26-27页 |
| ·古菌DNA复制原点 | 第27-28页 |
| ·DNA复制原点的共同特征 | 第28-29页 |
| ·原点识别复合物ORC和Cdc6蛋白 | 第29-36页 |
| ·ORC | 第29-30页 |
| ·Cdc6 | 第30-31页 |
| ·古菌的Orc1/Cdc6 | 第31页 |
| ·古菌Orc1/Cdc6的结构特征 | 第31-33页 |
| ·古菌Orc1/Cdc6的生化性质 | 第33-36页 |
| ·DNA复制性解旋酶—微染色体维持蛋白(MCM) | 第36-43页 |
| ·真核生物复制性解旋酶(MCM) | 第36-37页 |
| ·古菌MCM同源蛋白 | 第37-38页 |
| ·古菌MCM同源蛋白的结构特征 | 第38-40页 |
| ·古菌MCM同源蛋白的生化性质 | 第40-43页 |
| ·单链DNA结合蛋白 | 第43-45页 |
| ·其它DNA复制起始蛋白 | 第45-46页 |
| ·DNA复制的起始及其调控 | 第46-49页 |
| ·蛋白质/核酸相互作用研究方法进展 | 第49-52页 |
| ·DNase Ⅰ足迹试验 | 第49页 |
| ·凝胶电泳迁移率分析 | 第49页 |
| ·染色质免疫沉淀技术 | 第49-50页 |
| ·核酸适体技术 | 第50-51页 |
| ·表面等离子共振技术 | 第51-52页 |
| ·扫描探针显微镜技术 | 第52页 |
| ·蛋白质和蛋白质相互作用研究 | 第52-56页 |
| ·蛋白质亲和纯化分析 | 第52-53页 |
| ·免疫共沉淀 | 第53页 |
| ·交联技术 | 第53-54页 |
| ·酵母双杂交系统 | 第54-55页 |
| ·细菌双杂交系统 | 第55-56页 |
| ·本研究的选题依据、目的及内容 | 第56-60页 |
| ·选题依据 | 第56-57页 |
| ·研究的目的及意义 | 第57页 |
| ·本研究的思路和内容 | 第57-60页 |
| 2 材料和方法 | 第60-76页 |
| ·材料 | 第60-66页 |
| ·供试菌株 | 第60页 |
| ·用于基因克隆和蛋白表达的大肠杆菌菌株 | 第60页 |
| ·硫磺矿硫化叶菌P2菌株 | 第60页 |
| ·细菌双杂交菌株 | 第60页 |
| ·供试质粒 | 第60页 |
| ·酶、试剂和试剂盒 | 第60页 |
| ·寡核苷酸 | 第60-64页 |
| ·培养基 | 第64-65页 |
| ·抗生素 | 第65页 |
| ·缓冲液与试剂的配制 | 第65-66页 |
| ·方法 | 第66-76页 |
| ·S.solfataricus P2的培养 | 第66页 |
| ·S.solfataricus P2基因组DNA提取 | 第66页 |
| ·PCR扩增反应 | 第66页 |
| ·分子生物学基本操作方法 | 第66页 |
| ·表达载体的构建 | 第66-69页 |
| ·His-tag融合蛋白表达载体的构建 | 第66-67页 |
| ·SsoCdc6-1和-3 C-末端缺失突变原核表达载体的构建 | 第67页 |
| ·pET15bSsoCde6-1和pET15bSsoCdc6-3定点突变表达载体的构建 | 第67-69页 |
| ·SsoCde6和SsoMCM天然蛋白表达载体的构建 | 第69页 |
| ·蛋白的表达、纯化及蛋白浓度测定 | 第69-71页 |
| ·蛋白的诱导表达 | 第69页 |
| ·天然蛋白的热处理及His-tag融合蛋白的亲和纯化 | 第69-70页 |
| ·蛋白质透析 | 第70页 |
| ·蛋白质浓度的测定 | 第70-71页 |
| ·寡核苷酸底物的同位素标记 | 第71页 |
| ·凝胶电泳迁移率试验(EMSA) | 第71页 |
| ·Pull-down assay | 第71-72页 |
| ·His-tag融合蛋白抗血清的制备 | 第72-73页 |
| ·His-tag融合蛋白特异性抗体的亲和纯化 | 第73页 |
| ·Western-blotting检测抗原抗体的特异性结合 | 第73-74页 |
| ·细菌双杂交载体的构建及相互作用蛋白的筛选 | 第74-75页 |
| ·细菌双杂交载体的构建 | 第74页 |
| ·相互作用蛋白的筛选 | 第74-75页 |
| ·Native-PAGE | 第75-76页 |
| 3 结果与分析 | 第76-117页 |
| ·SsoCdc6与复制原点特异性DNA的相互作用研究 | 第76-90页 |
| ·SsoCde6-1、-2和-3氨基酸序列分析、结构预测和SsoCdc6-1KA、Cdc6-1△C、SsoCdc6-3KA、Cdc6-3△C突变体的设计 | 第76-77页 |
| ·His-tag SsoCdc6-1和-3原核表达载体的构建 | 第77页 |
| ·SsoCdc6-1和-3 C-末端缺失突变原核表达载体的构建 | 第77-78页 |
| ·SsoCdc6-1和-3定点突变表达载体的构建 | 第78-79页 |
| ·His-tag融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化 | 第79-80页 |
| ·蛋白质浓度的测定 | 第80页 |
| ·定点突变蛋白的包涵体表达及其二级结构的预测 | 第80-81页 |
| ·原点特异性DNA底物的设计 | 第81-84页 |
| ·SsoCdc6差异性结合不同的原点特异性DNA底物 | 第84-88页 |
| ·SsoCdc6和SsoCdc6△C以不同的亲和力结合DNA底物S1 | 第84-85页 |
| ·SsoCdc6和SsoCdc6△C以不同的亲和力结合DNA底物S2 | 第85-87页 |
| ·SsoCdc6和SsoCdc6△C以不同的亲和力结合DNA底物S3 | 第87-88页 |
| ·小结 | 第88-90页 |
| ·SsoCdc6之间的功能和物理相互作用研究 | 第90-103页 |
| ·表达SsoCdc6-1、-2、-3天然蛋白的重组表达载体的构建 | 第90-91页 |
| ·三个SsoCdc6及C-末端缺失突变体编码基因在双杂交载体的克隆 | 第91-92页 |
| ·SsoCdc6天然蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化 | 第92-93页 |
| ·SsoCdc6之间的功能相互作用 | 第93-98页 |
| ·SsoCdc6-1和SsoCdc6-2在DNA底物S2上的功能相互作用 | 第93-94页 |
| ·SsoCdc6-3和SsoCdc6-2在DNA底物S3上的功能相互作用 | 第94-96页 |
| ·SsoCdc6-1和SsoCdc6-3在DNA底物S3上的功能相互作用 | 第96-97页 |
| ·SsoCdc6-1和SsoCdc6-2在DNA底物S3上的功能相互作用 | 第97-98页 |
| ·SsoCdc6之间的物理相互作用 | 第98-102页 |
| ·细菌双杂交筛选SsoCdc6及缺失突变体之间的物理相互作用 | 第98-100页 |
| ·Protein pull-down/western blot分析SsoCdc6之间的物理相互作用 | 第100-102页 |
| ·小结 | 第102-103页 |
| ·SsoCdc6与SsoMCM之间的功能和物理相互作用研究 | 第103-111页 |
| ·表达天然蛋白SsoMCM的原核表达载体的构建 | 第103页 |
| ·天然蛋白SsoMCM与His-tag SsoMCM的表达和亲和纯化 | 第103-104页 |
| ·SsoMCM和oriC2序列特异性DNA底物之间的相互作用 | 第104-105页 |
| ·SsoMCM和SsoCdc6的功能相互作用 | 第105-108页 |
| ·SsoMCM和SsoCdc6的物理相互作用 | 第108-110页 |
| ·小结 | 第110-111页 |
| ·SsoCdc6与S.solfataricus DNA聚合酶(polB1)和单链结合蛋白(SSB)之间的相互作用研究 | 第111-117页 |
| ·His-tag SsopolB1原核表达载体的构建 | 第111-112页 |
| ·ssopolb1在细菌双杂交载体的克隆 | 第112页 |
| ·His-tag SsoSSB原核表达载体的构建 | 第112-113页 |
| ·ssossb在细菌双杂交载体pBT和pTRG的克隆 | 第113页 |
| ·SsopolB1和SsoSSB His-tag融合蛋白的表达和亲和纯化 | 第113-114页 |
| ·细菌双杂交筛选SsoCdc6和SsopolB1的物理相互作用 | 第114-115页 |
| ·细菌双杂交筛选SsoCdc6和SsoSSB的物理相互作用 | 第115-116页 |
| ·小结 | 第116-117页 |
| 4 讨论 | 第117-122页 |
| ·SsoCdc6 N-端存在特异序列在结合原点DNA过程中起重要作用? | 第117-118页 |
| ·三个SsoCdc6如何调控DNA复制的起始? | 第118-119页 |
| ·SsoCdc6之间相互作用不稳定? | 第119-120页 |
| ·SsoCdc6-2是SsoMCM的加载者? | 第120页 |
| ·SsoCdc6-1、-2和-3在DNA复制起始过程中发挥不同的作用? | 第120-121页 |
| ·SsoCdc6-3在DNA复制起始后期和延伸阶段也发挥一定的作用? | 第121-122页 |
| 5 本研究的创新性成果与下一步工作设想 | 第122-124页 |
| ·本研究的创新性成果 | 第122-123页 |
| ·下一步工作设想 | 第123-124页 |
| 参考文献 | 第124-136页 |
| 论文发表情况 | 第136-137页 |
| 致谢 | 第137页 |
