| 摘 要 | 第1-13页 |
| ABSTRACT | 第13-15页 |
| 1 引言 | 第15-27页 |
| ·植物基因工程表达载体的改进和优化策略 | 第15-17页 |
| ·转基因植物研究现状 | 第15-16页 |
| ·高效植物表达载体的构建 | 第16-17页 |
| ·MAR 在基因工程中的应用 | 第17-25页 |
| ·MAR 的分离鉴定 | 第17-18页 |
| ·MAR 序列的特征 | 第18-19页 |
| ·MAR 的序列结合蛋白 | 第19-20页 |
| ·MAR 对外源基因转化频率和表达水平的影响 | 第20-21页 |
| ·MAR 对外源基因转化频率的影响 | 第20-21页 |
| ·MAR 对外源基因表达水平高低的影响 | 第21页 |
| ·ARS 元件在基因工程中的应用 | 第21-23页 |
| ·ARS 元件分离和序列特征 | 第21-22页 |
| ·ARS 功能 | 第22页 |
| ·ARS 序列与 MAR 序列的关系 | 第22-23页 |
| ·MAR 序列作用的分子机理 | 第23-25页 |
| ·MAR序列与Loop环模型 | 第23-24页 |
| ·MAR 序列作用的其它模型 | 第24-25页 |
| ·本课题的目的和意义 | 第25-27页 |
| 2 材料与方法 | 第27-47页 |
| ·试验材料 | 第27-28页 |
| ·植物材料 | 第27页 |
| ·菌株与质粒 | 第27页 |
| ·酶及生化试剂 | 第27页 |
| ·PCR 引物 | 第27-28页 |
| ·实验方法 | 第28-47页 |
| ·烟草和水稻基因组DNA 的提取(小量法) | 第28-29页 |
| ·烟草 MAR 序列的扩增 | 第29-30页 |
| ·PCR 产物与克隆载体的连接 | 第30页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第30-31页 |
| ·转化与筛选 | 第31页 |
| ·碱法小量提取质粒 DNA | 第31-32页 |
| ·碱法大量提取质粒DNA | 第32页 |
| ·载体去磷酸化 | 第32页 |
| ·目的片段的凝胶回收 | 第32-33页 |
| ·农感菌感受态细胞的制备 | 第33页 |
| ·冻融法转化农杆菌 | 第33-34页 |
| ·农杆菌的培养 | 第34页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第34-36页 |
| ·正向插入 TM2 的烟草表达载体的构建 | 第34-35页 |
| ·正向插入 TM2 的水稻表达载体的构建 | 第35-36页 |
| ·正向插入220MAR的烟草表达载体的构建 | 第36页 |
| ·基因枪法转化烟草悬浮细胞 | 第36-37页 |
| ·农杆菌介导的烟草转化 | 第37-38页 |
| ·农杆菌介导的水稻转化 | 第38页 |
| ·转基因烟草和水稻 PCR 检测 | 第38-39页 |
| ·转基因烟草的 GUS 组织分析 | 第39-40页 |
| ·转基因烟草和水稻的GUS 活性分析 | 第40-42页 |
| ·新鲜的植物组织 GUS 蛋白的提取 | 第40页 |
| ·GUS 蛋白提取液蛋白含量测定(Bradford 法) | 第40-41页 |
| ·GUS 酶活反应 | 第41页 |
| ·荧光测定 | 第41页 |
| ·酶活力计算 | 第41-42页 |
| ·转基因植株的 Southern 杂交 | 第42-44页 |
| ·植物基因组 DNA 的制备 | 第42-43页 |
| ·限制性内切酶消化 | 第43页 |
| ·转膜 | 第43页 |
| ·预杂交 | 第43页 |
| ·探针合成 | 第43页 |
| ·洗膜及显影 | 第43-44页 |
| ·转基因植株的 Northern 杂交 | 第44-45页 |
| ·RNA 提取 | 第44页 |
| ·RNA 甲醛变性凝胶电泳 | 第44页 |
| ·转膜及烘膜 | 第44-45页 |
| ·杂交 | 第45页 |
| ·洗膜及压片 | 第45页 |
| ·MAR 序列侧翼序列分析 | 第45-47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-63页 |
| ·TM2 对转基因效率的影响 | 第47-55页 |
| ·TM2 对烟草转化的影响 | 第47-51页 |
| ·烟草表达载体的构建 | 第47-48页 |
| ·农杆菌介导的烟草转化 | 第48页 |
| ·TM2对烟草转化频率的影响 | 第48-49页 |
| ·转基因烟草植株的 PCR 鉴定 | 第49-50页 |
| ·转基因烟草 GUS 酶活测定 | 第50-51页 |
| ·TM2 对水稻转化的影响 | 第51-53页 |
| ·水稻表达载体的构建 | 第51页 |
| ·农杆菌介导的水稻转化 | 第51页 |
| ·TM2 对水稻转化频率的影响 | 第51-52页 |
| ·转基因水稻植株的 PCR 鉴定 | 第52-53页 |
| ·转基因水稻的 GUS 酶活测定 | 第53页 |
| ·TM2 提高转化频率的机理研究 | 第53-55页 |
| ·部分转基因植株的 Southern 分析 | 第53-54页 |
| ·部分转基因植株的 Northern 分析 | 第54-55页 |
| ·220MAR 对转基因表达水平和转化效率的影响 | 第55-61页 |
| ·220MAR 烟草表达载体的构建 | 第55-57页 |
| ·220MAR 对转基因烟草瞬时表达的影响 | 第57-58页 |
| ·220MAR对转基因烟草稳定表达的影响 | 第58-61页 |
| ·220MAR 对烟草转化频率的影响 | 第58-59页 |
| ·基因植株的PCR鉴定 | 第59页 |
| ·转基因烟草植株的组织化学染色 | 第59-60页 |
| ·转基因烟草的GUS 酶活测定 | 第60-61页 |
| ·MAR 侧翼序列的扩增 | 第61-63页 |
| ·野生烟草植株的 Southern 杂交分析 | 第61页 |
| ·反向 PCR(IPCR)扩增 TM2 侧翼序列 | 第61-63页 |
| 4 讨论 | 第63-67页 |
| ·TM2 对转基因表达水平和转化效率的影响 | 第63页 |
| ·220MAR 对转基因表达水平和转化效率的影响 | 第63-64页 |
| ·高效表达载体构建 | 第64-65页 |
| ·展望 | 第65-67页 |
| 5 结论 | 第67-68页 |
| 6 参考文献 | 第68-76页 |
| 附录1 | 第76-82页 |
| 附录2 | 第82-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 硕士期间发表的主要学术论文 | 第85页 |