| 第一章 文献综述 | 第1-22页 |
| ·淀粉生物合成及其关键酶研究进展 | 第10-17页 |
| ·ADP葡萄糖焦磷酸化酶 | 第14页 |
| ·淀粉合成酶(SS)和颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS) | 第14-15页 |
| ·淀粉分支酶(BE) | 第15-16页 |
| ·淀粉脱支酶(DBE) | 第16-17页 |
| ·淀粉合成关键酶的功能研究及基因工程调控途径 | 第17-22页 |
| ·正向遗传学方法—表型突变体的利用 | 第17-18页 |
| ·反向遗传学方法 | 第18-22页 |
| ·单链正义RNA介导的共抑制 | 第18-19页 |
| ·单链反义RNA介导的基因抑制 | 第19页 |
| ·hPRNA介导的基因沉默 | 第19-20页 |
| ·水稻Tos17插入突变 | 第20-22页 |
| 第二章 材料和方法 | 第22-37页 |
| ·供试材料 | 第22页 |
| ·iHP载体构建方法 | 第22-27页 |
| ·PCR | 第22-23页 |
| ·PCR反应体系 | 第22页 |
| ·PCR反应程序 | 第22页 |
| ·10×PCR反应缓冲液 | 第22-23页 |
| ·连接 | 第23页 |
| ·电转化感受态细胞制备 | 第23-24页 |
| ·大肠杆菌质粒电转化 | 第24页 |
| ·细菌选择培养基的抗生素浓度 | 第24-25页 |
| ·微量制备质粒DNA | 第25页 |
| ·质粒DNA酶切及琼脂糖电泳 | 第25-26页 |
| ·DNA测序 | 第26-27页 |
| ·测序反应 | 第26页 |
| ·测序程序 | 第26页 |
| ·酒精/醋酸钠沉淀纯化测序反应液 | 第26-27页 |
| ·农杆菌介导水稻转化 | 第27-28页 |
| ·电击转化农杆菌 | 第27页 |
| ·愈伤组织诱导 | 第27页 |
| ·愈伤组织继代 | 第27-28页 |
| ·水稻转化 | 第28页 |
| ·转基因整合检测 | 第28-32页 |
| ·PCR检测DNA快速提取 | 第28页 |
| ·Southern杂交 | 第28-32页 |
| ·DNA大量提取 | 第28-29页 |
| ·DNA酶切及琼脂糖电泳 | 第29页 |
| ·探针制备 | 第29-30页 |
| ·Southern杂交 | 第30-32页 |
| ·极限糊精酶积累检测 | 第32-37页 |
| ·蛋白质的提取 | 第32页 |
| ·SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰铵凝胶电泳) | 第32-33页 |
| ·Western杂交 | 第33-35页 |
| ·变性/复性SDS-PAGE | 第35页 |
| ·银染 | 第35-37页 |
| 第三章 结果与分析 | 第37-47页 |
| ·极限糊精酶基因iHP载体构建 | 第37-40页 |
| ·pZLRint9-Rpul | 第38-39页 |
| ·pZLBx17—Rpul | 第39-40页 |
| ·Pwbvec8—ZLBx17—Rpul | 第40页 |
| ·农杆菌介导的iHP质粒转化水稻 | 第40-41页 |
| ·iHP转化体鉴定 | 第41-42页 |
| ·PCR | 第41-42页 |
| ·Southern杂交 | 第42页 |
| ·Tos17插入极限糊精酶基因纯合突变体筛选及突变效果分析 | 第42-45页 |
| ·Tos17插入位点 | 第42-44页 |
| ·Tos17插入突变体PCR鉴定 | 第44-45页 |
| ·极限糊精酶在发育种子中的积累 | 第45-47页 |
| ·Western杂交检测 | 第45页 |
| ·变性/复性SDS-PAGE分析 | 第45-46页 |
| ·对其它淀粉合成关键酶积累的影响 | 第46-47页 |
| 第四章 讨论 | 第47-54页 |
| ·转录后基因沉默(PTGS)和RNAi技术的发展 | 第47-48页 |
| ·RNAi现象的发现及定义 | 第47页 |
| ·dsRNA诱导的基因沉默与外源基因沉默的区别 | 第47页 |
| ·RNAi技术的发展 | 第47-48页 |
| ·iHP载体构建和转化 | 第48-49页 |
| ·内含子的应用 | 第48页 |
| ·目标基因片段的选择 | 第48-49页 |
| ·农杆菌介导的水稻转化 | 第49页 |
| ·Tos17插入突变的效果 | 第49页 |
| ·基因工程改良作物淀粉品质 | 第49-50页 |
| ·淀粉含量的调控 | 第50页 |
| ·淀粉结构的调控 | 第50页 |
| ·进一步的工作 | 第50-51页 |
| ·RNAi技术应用前景 | 第51-54页 |
| ·基因功能研究 | 第51-52页 |
| ·作物品质改良 | 第52-54页 |
| 第五章 结论 | 第54-55页 |
| 附件 | 第55-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-74页 |
| 作者简介 | 第74-76页 |
| Abstract | 第76-79页 |
| Chapter 1 Literature Review | 第79-87页 |
| ·The key enzymes involved in starch biosynthesis | 第79-82页 |
| ·ADP-Glc pyrophosphorylase | 第79-80页 |
| ·Geanule-bound starch synthase (GBSS) and starch synthase (SS) | 第80页 |
| ·Starch-branching enzyme (SBE) | 第80-81页 |
| ·Starch debranching enzyme (DBE) | 第81-82页 |
| ·Gene functional investigation and genetic engineering of the key enzymes | 第82-87页 |
| ·Forward genetics technology —Using of the losing of function mutants | 第82页 |
| ·Reverse genetics approaches | 第82-87页 |
| ·Cossupression mediated by sense RNA | 第83-84页 |
| ·Antisense RNA suppression | 第84-85页 |
| ·dsRNA mediated gene silencing | 第85页 |
| ·insertional mutagen Tosl7 | 第85-87页 |
| Chapter 2 Materials and Methods | 第87-103页 |
| ·Materials | 第87页 |
| ·Vector Construction | 第87-91页 |
| ·PCR of Plant DNA Fragment | 第87页 |
| ·Ligation | 第87-88页 |
| ·Competent Cell Preparation for Transformation by Electroporation | 第88页 |
| ·E.coli Transformation by Electroporation | 第88-89页 |
| ·Antibiotics Concentration for the Selection of clones | 第89页 |
| ·Minipreparation of Plasmid DNA (alkaline method) | 第89-90页 |
| ·Digestion of Plasmid DNA and Agarose Electrophoresis | 第90页 |
| ·DNA Sequencing | 第90-91页 |
| ·Rice Transformation Mediated by Agrobacterium | 第91-93页 |
| ·Agrobacteria Transformation by Electroporation | 第91-92页 |
| ·Callus Induction | 第92页 |
| ·Subculture | 第92页 |
| ·Rice Transformation | 第92-93页 |
| ·Detection of Transgenic Lines | 第93-97页 |
| ·Fast DNA Kit protocol for PCR | 第93页 |
| ·Southern Blotting | 第93-97页 |
| ·Detection of Pullulanase activity | 第97-100页 |
| ·Protein Extraction | 第97-98页 |
| ·SDS-PAGE | 第98页 |
| ·Western Blotting | 第98-100页 |
| ·The affect of Pullulanase Gene Silencing on other enzymes in starch biosynthesis | 第100-103页 |
| ·Denature/nature SDS-PAGE | 第100-101页 |
| ·Silver Stain | 第101-103页 |
| Chapter 3 Results | 第103-113页 |
| ·Vector Construction | 第103-107页 |
| ·pZLRint9-Rpul | 第104-105页 |
| ·pBx17-Rpul | 第105-106页 |
| ·pWbvec8-ZLBx17-Rpul | 第106-107页 |
| ·Rice transformation of the Duplex Construct mediated by Agrobacterium | 第107页 |
| ·Detection of duplex construct in genome of transgenic lines | 第107-108页 |
| ·PCR screening | 第107-108页 |
| ·Southern Analysis | 第108页 |
| ·Screening for homozygous Tos17 insertion mutants | 第108-111页 |
| ·Detection of Tos17 insertion position | 第108-110页 |
| ·Screening of homozygous Tos17 insertion mutants | 第110-111页 |
| ·Expression of Pullulanase in T_1 Developing Endosperms | 第111-113页 |
| ·Westen analysis | 第111页 |
| ·Denature/renature SDS-PAGE | 第111-112页 |
| ·The effect of RNAi in pullulanase gene on other genes involved in starch biosynthesis | 第112-113页 |
| Chapter 4 Discussion | 第113-116页 |
| ·The duplex construct of RNAi | 第113页 |
| ·The gene silencing effects on pullulanase | 第113-114页 |
| ·Further Work | 第114-115页 |
| ·Perspectives of dsRNA mediated RNAi technique | 第115-116页 |
| Acknowledgments | 第116页 |
