| 中文摘要 | 第1-14页 |
| Abstract | 第14-17页 |
| 绪论 | 第17-18页 |
| 第一章 食线虫真菌侵染性胞外酶及分子生物学研究进展 | 第18-25页 |
| 1 前言 | 第18页 |
| 2 食线虫真菌胞外酶研究简况 | 第18-22页 |
| ·纤维素酶和木质素酶 | 第19页 |
| ·几丁质酶 | 第19页 |
| ·胶原蛋白酶 | 第19-20页 |
| ·丝氨酸类蛋白酶 | 第20-22页 |
| 3 食线虫真菌分子生物学研究进展 | 第22-23页 |
| 4 食线虫真菌胞外蛋白酶基因工程研究展望 | 第23-25页 |
| 第二章 捕食线虫真菌胞外蛋白酶的纯化鉴定与基因克隆 | 第25-54页 |
| 1 前言 | 第25-26页 |
| 2 材料和方法 | 第26-38页 |
| ·材料与器械 | 第26-28页 |
| ·实验方法 | 第28-38页 |
| ·寡孢节丛孢的胞外蛋白酶产生 | 第28页 |
| ·纯化方案 | 第28-31页 |
| ·纯酶的酶学性质研究 | 第31-32页 |
| ·电印迹和氨基末端序列分析 | 第32页 |
| ·基因克隆实验 | 第32-37页 |
| ·根据氨基末端序列设计简并引物序列 | 第33页 |
| ·提取真菌总 RNA | 第33页 |
| ·成熟蛋白酶 cDNA 序列的克隆 | 第33-37页 |
| ·基因调控序列的扩增 | 第37页 |
| ·基因组 DNA 序列的扩增 | 第37-38页 |
| 3 结果 | 第38-50页 |
| ·高产蛋白酶菌株的筛选预实验 | 第38-40页 |
| ·胞外蛋白酶的产生及产酶曲线 | 第40页 |
| ·胞外蛋白酶的纯化 | 第40-41页 |
| ·纯化蛋白酶的性质鉴定和氨基末端序列分析结果 | 第41-43页 |
| ·蛋白酶处理线虫的生测结果 | 第43-44页 |
| ·目的克隆的筛选与鉴定 | 第44-46页 |
| ·基因克隆结果及基因序列中编码框(ORF)的确认 | 第46-50页 |
| 4 结论与讨论 | 第50-54页 |
| ·捕食线虫真菌胞外侵染性蛋白酶及其基因 | 第50-51页 |
| ·优化的 LMZ 培养基 | 第51页 |
| ·硫酸铵分级沉淀 | 第51-52页 |
| ·蛋白质的电转测序 | 第52页 |
| ·丝氨酸蛋白酶 | 第52-53页 |
| ·提取真菌总 RNA 的菌丝材料 | 第53页 |
| ·丝氨酸蛋白酶作为致病毒力因子 | 第53-54页 |
| 第三章 粉红螺旋聚孢霉胞外蛋白酶纯化鉴定与酶基因 cDNA 克隆 | 第54-69页 |
| 1 前言 | 第54页 |
| 2 材料与方法 | 第54-56页 |
| ·出发菌株 | 第54页 |
| ·试剂和分子生物学常用酶、主要仪器设备 | 第54-55页 |
| ·实验方法 | 第55-56页 |
| ·胞外蛋白酶的产生和粗酶对线虫的固定作用 | 第55页 |
| ·胞外蛋白酶的纯化 | 第55页 |
| ·蛋白酶的一般酶学性质 | 第55页 |
| ·抑制剂效应 | 第55页 |
| ·蛋白酶活力测定 | 第55-56页 |
| ·酶的动力学性质测定 | 第56页 |
| ·蛋白酶的热稳定性测定 | 第56页 |
| ·蛋白酶的抗氧化性测定 | 第56页 |
| ·光学显微镜观察纯酶对线虫体壁的降解作用 | 第56页 |
| ·基因克隆实验 | 第56页 |
| 3 结果 | 第56-66页 |
| ·粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea) 的种征描述 | 第56-57页 |
| ·粉红螺旋聚孢霉(C. rosea)高毒力菌株对线虫的侵染 | 第57-58页 |
| ·纯化蛋白酶对线虫的固定及酶学性质 | 第58-66页 |
| 4 结论与讨论 | 第66-69页 |
| ·SMART-RACE 扩增 5’端调控序列 | 第66-67页 |
| ·碱性蛋白酶 | 第67-68页 |
| ·免疫定位(immunolocalization)研究 | 第68页 |
| ·粉红螺旋聚孢霉胞外蛋白酶研究 | 第68-69页 |
| 第四章 克隆化碱性蛋白酶 cDNA 基因的异源系统表达 | 第69-82页 |
| 1 前言 | 第69-70页 |
| 2 材料与方法 | 第70-76页 |
| ·质粒载体和菌株(特性见附录) | 第70页 |
| ·限制性内切酶和碱性磷酸酶 | 第70页 |
| ·工程酵母菌生长培养基 | 第70页 |
| ·电转化实验器材 | 第70-71页 |
| ·重组碱性蛋白酶的表达方案 | 第71-76页 |
| 3 结果 | 第76-79页 |
| 4 结论与讨论 | 第79-82页 |
| 第五章 重组表达蛋白质的免疫学检测分析 | 第82-91页 |
| 1 前言 | 第82-83页 |
| 2 材料与方法 | 第83-87页 |
| ·实验动物、试剂和器材 | 第83-84页 |
| ·电泳印迹分析 | 第84页 |
| ·空白对照实验 | 第84-85页 |
| ·供试 BALB/C 小白鼠的免疫 | 第85页 |
| ·抗血清的滴度检测 | 第85-86页 |
| ·抗血清的印迹分析 | 第86-87页 |
| 3 结果 | 第87-89页 |
| ·血清滴度 | 第87-88页 |
| ·表达产物的免疫学检测 | 第88页 |
| ·重组表达蛋白酶的分子量测定 | 第88-89页 |
| 4 结论与讨论 | 第89-91页 |
| 第六章 食线虫担子菌胞外蛋白酶的纯化与性质鉴定 | 第91-100页 |
| 1 前言 | 第91页 |
| 2 材料与方法 | 第91-92页 |
| ·出发菌株 | 第91页 |
| ·生化试剂和纯化用层析填料 | 第91页 |
| ·菌丝的液体培养发酵产酶 | 第91页 |
| ·胞外蛋白酶的纯化 | 第91-92页 |
| ·蛋白酶活力测定 | 第92页 |
| ·纯化蛋白酶的性质鉴定和氨基末端分析 | 第92页 |
| 3 结果 | 第92-97页 |
| ·出发菌株选择及毛头鬼伞种征描述 | 第92-93页 |
| ·毛头鬼伞胞外蛋白酶的纯化 | 第93-94页 |
| ·纯酶的酶学性质 | 第94-96页 |
| ·酶对线虫的作用 | 第96-97页 |
| ·纯化蛋白酶的氨基末端序列分析 | 第97页 |
| ·高毒力毛头鬼伞(Coprinus comatus)菌株对线虫的毒杀作用 | 第97页 |
| 4 结论与讨论 | 第97-100页 |
| 全文小结 | 第100-102页 |
| 参考文献 | 第102-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
| 附录1 论文中使用的缩写词及中英文对照 | 第109-110页 |
| 附录2 实验中使用的贮存液、缓冲液、培养基配制 | 第110-112页 |
| 附录3 分子设计辅助软件和网上资源 | 第112-114页 |
| 附录4 实验中常用的核酸、蛋白质换算 | 第114页 |
| 附录5 等电点测定实验操作方法 | 第114-116页 |
| 附录6 胞外酶氨基末端序列、DNA 序列及同源性分析 | 第116-119页 |
| 附录7 实验中使用的菌株载体特性及载体酶切图谱 | 第119-123页 |
| 附录8 读博期间发表、撰写的学术论文 | 第123-124页 |
| 附录9 读博期间参加的国际国内学术会议和申请的发明专利 | 第124-125页 |
